Пиросеквени́рование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК ), основанный на принципе «секвенирование путём синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов . Технология была разработана ( швед. Pål Nyrén ) и его студентом англ. Mostafa Ronaghi ) в Королевском технологическом институте ( Стокгольм ) в 1996 году .

Процедура

Идея пиросеквенирования заключается в регистрации пирофосфата, который образуется при присоединении очередного нуклеотида ДНК-полимеразой . Детекция пирофосфата осуществляется за счёт каскада химических реакций , который заканчивается выделением кванта света .

Прежде всего создаётся иммобилизованная на твёрдой фазе клональная одноцепочечных фрагментов ДНК (например, при помощи мостиковой полимеразной цепной реакции , ПЦР). Ко всем фрагментам ДНК присоединяется адаптер, с которым будет комплементарно связываться праймер — затравка для синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразой. Далее производится серия последовательных циклов, в процессе которых к закреплённой на твёрдой фазе ДНК по очереди добавляют дезоксинуклеотидтрифосфаты всех четырёх типов: A, T, G, C. Если на секвенируемой цепи ДНК есть комплементарный к добавленному нуклеотид, то при образовании побочным продуктом станет пирофосфат. Он активирует каскад химических реакций: пирофосфат вместе с аденозинсульфофосфатом (АСФ) при помощи фермента образуют АТФ , который является источником энергии для проведения реакции окисления люциферина в оксилюциферин с выделением кванта света. Интенсивность выделяемого света пропорциональна числу включённых в цепь нуклеотидов (чем больше подряд одинаковых нуклеотидов, тем сильнее световой сигнал). Детекция света осуществляется ПЗС-матрицей и анализируется с помощью программного обеспечения, которое строит по пирограмме последовательность нуклеотидов. Нуклеотиды, не вовлечённые в синтез новой цепи, а также АТФ разрушаются ферментом . После этого начинается следующий цикл, то есть добавляется нуклеотид другого типа .

Позднее Маргулис и соавторы предложили сочетание пиросеквенирования с эмульсионной ПЦР .

Коммерциализация

Компания Pyrosequencing AB, которая располагается в Уппсале , Швеция , коммерциализовала технологию и реагенты для секвенирования коротких участков ДНК. В 2003 году Pyrosequencing AB переименована в «Biotage». В 2008 году Qiagen приобрел Biotage . На принципе пиросеквенирования основана коммерческая технология 454 Life Sciences (компания ) .

Достоинства и недостатки

По сравнению с секвенированием по Сэнгеру , пиросеквенирование выгодно отличается стоимостью, а также тем, что за один раз можно получить сотни тысяч . Однако пиросеквенирование имеет и ряд недостатков. Так, с помощью этого метода невозможно безошибочно секвенировать протяжённые участки, состоящие из одного и того же нуклеотида. Кроме того, оно позволяет получать лишь прочтения небольшой длины. Четвёртое поколение технологий пиросеквенирования, например, GS FLX Titanium, позволяет получать прочтения длиной более 400 пар оснований .

Литература

• Д. В. Ребриков, Д. О. Коростин, Е. С. Шубина, В. В. Ильинский. NGS: высокопроизводительное секвенирование / под общей редакцией Д. В. Ребрикова. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. — 232 с. — ISBN 978-5-9963-0373-1 .

Примечания

Ссылки

• Натальин, Павел. (неопр.) . // Сайт Biomolecula.ru (6 февраля 2008). Дата обращения: 21 марта 2018. 7 апреля 2018 года.
• Недолужко, Артём; Пташник, Ольга. (неопр.) . // Сайт Biomolecula.ru (11 августа 2017). Дата обращения: 21 марта 2018.