Химические цветовые реакции — изменение цвета различных макро- и микроскопических структур грибов под действием некоторых химических реактивов . Химический метод исследования используется при идентификации образцов грибов для различения таксономических групп. Таксономическим признаком может служить как положительный или отрицательный результат исследования, так и вариации в изменении окраски при положительных реакциях, поскольку один и тот же реактив может давать разное окрашивание у разных видов грибов.

Могут проводиться простые тесты по выявлению характерных реакций мякоти плодового тела в целом или микроскопические исследования, обнаруживающие цветные реакции гиф , спор , базидий и других элементов трамы или мицелия . Исследования могут проводиться на свежесобранных экземплярах грибов, а некоторые и на гербарных образцах.

Значение и история метода

Макроскопические признаки плодовых тел, а иногда и признаки, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании, могут быть недостаточными для однозначного определения. В таких случаях используют цветные химические реакции как дополнительный критерий таксонов .

Применяемые аналитические реактивы в большинстве случаев не являются специфическими для определённых веществ или комплексов веществ, содержащихся в грибах, однако они часто оказываются специфичными для определённых таксонов грибов, что и позволяет широко использовать метод. Некоторые из используемых реакций являются специфическими, например, положительная реакция с бензидином и α-нафтолом указывает на наличие в мякоти гриба фермента лакказы , с фенолом — тирозиназы, а тест на амилоидность позволяет не только определить наличие в клетках специфичных полисахаридов ( глюканов ), но и сделать определённые выводы о строении их макромолекул.

Впервые химический метод был применён в 1866 году финским ботаником Вильямом Нюландером (1822—1899) для систематики лишайников . Нюландер заметил, что разные виды по-разному реагируют на воздействие растворами щелочей, гипохлоритов , иода , и другими реактивами.

Позже Мюллер изучал действие химических реактивов на полипоровые грибы и обнаружил появление фиолетовой окраски у Hapalopilus nidulans ; Харлей открыл исчезновение фиолетовой окраски мякоти груздя чёрного под действием щёлочи. В течение всего XX века действие химических реактивов на грибы изучалось многими известными микологами ( , 1924; Ю. Шеффер и Ф. Мёллер, 1938; Р. Кюнер и А. Романьези , 1953; Р. Зингер , 1951, 1962, 1969, 1975; А. Майкснер, 1975; С. П. Вассер , 1980, 1992). Наиболее полные данные о химических цветовых реакциях баздиальных грибов содержатся в работах Кюнера и Романьези, Зингера (1975), Майкснера, Вассера. Для лишайников химический метод углублённо изучался в 1930-х годах японским микологом Я. Асахиной и подробно описан А. Н. Окснером .

В отношении самого́ химического метода среди микологов существуют два противоположных мнения:

• На основании только химических реакций описываются новые таксоны, иногда даже роды, при этом совершенно не учитываются другие критерии, особенно условия произрастания грибов.
• Некоторые же учёные не придают значения методу как дополнительному критерию таксонов.

С. П. Вассер приводит две цитаты, характеризующие оба существующих подхода:

Время от времени делаются попытки использования химических опытов для определения видов грибов и лишайников, что часто вызывает бурю протестов. Однако в группе, которая представляет трудность для классификации и количество признаков которой невелико или, наоборот, очень разнообразно, поступление дополнительных сведений должно только приветствоваться.

— А. Берджес

Химический метод как один из удобных, быстрых и надёжных, как дающий дополнительную информацию в суждениях о виде и других таксонах, следует широко использовать, но непременно вместе с другими методами систематики, особенно морфологическими.

— А. Н. Окснер, Определитель лишайников СССР. Морфология, систематика и географическое распространение

Часто используемые реактивы

Результаты исследования часто записываются в кратком виде с использованием химических формул (для неорганических реактивов) или сокращённых обозначений, которые могут различаться у разных авторов, поэтому в публикациях приводятся списки условных обозначений. В зависимости от применимости реакции к данной таксономической группе, может указываться только положительный или отрицательный результат (например, запись «KOH+»/«KOH-» означает положительную/отрицательную реакцию со щёлочью) или указывается изменение окраски (например, «KOH+ желтеет»). Также указывается часть плодового тела или определённая микроструктура, если действие реагента неодинаково для разных структур гриба .

• Аммиак NH ₃ или NH ₄ OH (25%-й водный раствор или пары́ нашатырного спирта ) у агариковых грибов даёт зелёное, реже жёлтое окрашивание , у других базидиомицетов может появляться розоватая, оливковая, фиолетовая, серовато-чёрная окраска . В лихенологии применяется редко .
• Анилин C ₆ H ₅ NH ₂ применяется в чистом виде или в виде 50%-й водной эмульсии, сокращённо обозначается «А». При положительной реакции у базидиомицетов даёт красноватое, медно-красное, жёлтое, жёлто-оранжевое, тёмно-коричневое или оливковое окрашивание .
• Ароматические диамины
  • Бензидин 4,4'-(C ₆ H ₄ NH ₂ ) ₂ в виде спиртового раствора даёт голубую окраску, свидетельствующую о наличии лакказы . Реагент является сильным канцерогеном , поэтому его на практике заменяют (диметилбензидином), который значительно менее опасен и даёт ту же реакцию, что было показано в работе Х. Клеменсона [Clemençon, Schweiz. Zeitschr. f.Pilzk., 1969, 47].
  • пара -Фенилендиамин 1,4-C ₆ H ₄ (NH ₂ ) ₂ может обозначаться как P или Pd, используется в виде 2%-го спиртового или 1%-го водного раствора, в 1934 году этот реагент был введён в практику лихенологии Я. Асахиной. В присутствии кислорода воздуха растворы п -фенилендиамина быстро окисляются и приходят в негодность, поэтому перед использованием их проверяют на образце «оленьего мха» Cladonia rangiferina , который даёт интенсивную красную окраску. Для предохранения реактива от окисления в водный раствор добавляют 10 % сульфита натрия . Такой раствор, называемый реактивом Штейнера , сохраняется значительно дольше .
• Гваякол (спиртовой раствор или настойка семян растения Guajacum officinale ) даёт окрашивание в голубовато-зелёные, голубовато-серые, оливковые или красно-коричневые тона.
• Концентрированные растворы кислот могут давать различные цветовые реакции, используются на свежем материале:
  • 60—70%-я серная кислота ,
  • 65%-я азотная кислота ,
  • 25%-я соляная кислота ,
  • Молочная кислота .
• Лактофенол — смесь равных частей молочной кислоты и фенола , при положительной реакции даёт окрашивание коричневых, розово-фиолетовых, лиловых, красноватых оттенков.
• Карболовая кислота (2,5%-й раствор фенола ) даёт красноватую, желтоватую, коричневую или фиолетовую окраску. Реакция считается положительной, если окраска появляется в течение 20 минут.
• α-Нафтол (водно-спиртовой раствор) окрашивает в фиолетовый или красноватый цвет, реакция проходит за 2—4 минуты.
• Пирамидон (водный раствор) даёт реакцию с окрашиванием в сиренево-фиолетовый цвет.
• Пирогаллол (спиртовой раствор) окрашивает в коричневые тона.
• Сульфованилин — раствор 1 г ванилина в смеси 8 мл концентрированной серной кислоты и 3 мл дистиллированной воды на свежем материале даёт окрашивание в пурпурные, коричневые, розово-фиолетовые цвета. Впервые применён Арнуольдом и Горисом в 1907 году .
• Сульфоформалин — смесь формалина и 60—70%-й серной кислоты. Используется на свежем материале и на образцах, хранившихся в формалине не более 6 месяцев. При положительной реакции медленно появляется коричневое окрашивание.
• Феноланилин — смесь 3 капель анилина , 5 капель концентрированной серной кислоты и 10 мл карболовой кислоты. Положительная реакция заключается в появлении окраски ржаво-розового, пурпурно-красного или лилово-розового цвета, который затем переходит в шоколадно-коричневый.
• Формалин окрашивает в фиолетово-коричневый или красноватый цвет.
• 10%-й раствор хлорида железа (III) даёт зеленоватое окрашивание, затем переходящее в тёмно-серый цвет.
• 10%-й раствор сульфата железа (II) с добавлением серной кислоты окрашивает мякоть в зелёный, оливковый, оранжевый или коричневый цвет.
• Растворы щелочей ( гидроксида калия или натрия ) дают окрашивание в розовый, жёлтый, красно-коричневый или оранжевый цвет, реакция пригодна и для гербарного материала. Почернение бурой мякоти некоторых трутовиковых грибов под действием щёлочи называют ксантохроидной реакцией .

Другие методики

Тест на амилоидность

Амилоидностью называют способность структур окрашиваться под действием растворов иода . Обычно применяется реактив Мельцера : к водному раствору, содержащему 2,5 % иода и 7,5 % иодида калия добавляют равный объём хлоралгидрата . Реакция применяется как макроскопическая и для окрашивания препаратов при микроскопировании, что даёт возможность определить амилоидность различных структур: спор, гиф , базидий . Амилоидность проявляется и у образцов, длительное время (более 100 лет) хранившихся в гербарии (по данным Зингера, 1975) . Наличие и степень амилоидности позволяет определить особенности строения молекул глюканов — полисахаридов , сходных с крахмалом , а также мощность глюканового слоя на поверхности микроскопических структур гриба. Иод адсорбируется в случае сильно развитого поверхностного слоя в каналах между глюкановыми цепочками. Если цепочки сильно разветвлённые, реакция даёт жёлто-коричневую окраску, при наличии менее разветвлённых цепочек проявляется собственно амилоидная реакция — интенсивное посинение, аналогичное известной в аналитической химии иодокрахмальной реакции. Обычно различают структуры неамилоидные (не окрашиваются), декстриноидные , или псевдоамилоидные (окрашиваются в жёлтые и коричневые тона) и амилоидные (окрашиваются в голубой, синий, до почти чёрного) .

В 2005 г. и соавторами предложено определять степени градации этой реакции в соответствии со шкалой цветов (в скобках — обозначение цвета по шкале [Petersen, 1996]):

• слабодекстриноидная — от бледно-коричневого (P14) до бледно-оливкового (P16)
• декстриноидная — желтовато-бурый (P9)
• сильнодекстриноидная — оранжево-бурый (P7)
• неясно-амилоидная — от бледно-мышино-серого (P53) до бледно-фиолетово-серого (P59)
• слабоамилоидная — мышино-серый (P55)
• амилоидная — от голубовато-серого (P57) до тёмно-голубовато-серого (P56)
• сильноамилоидная — от винно-серого (P58) до серовато-фиолетового (P44)

Реакция Шеффера

Перекрёстная реакция Шеффера : стеклянной палочкой наносят на срез полоску раствора анилина, а затем, пересекая её, полоску 65%-й азотной кислоты. При положительной реакции в месте пересечения появляется хромово-жёлтое пятно, затем окраска переходит в оранжево-красную. Реакция Шеффера — важный внутриродовой признак для рода Agaricus . Пригодна для материала, длительно хранившегося в гербарии. Открыта Ю. Шеффером в 1933 г.

Применение красителей

Окрашивание органическими красителями применяется как для улучшения оптических свойств микроскопических препаратов, так и для характеристики окрашенных структур. Например, при окрашивании толуидиновыми красителями ( ) различают цианофилию — синеватое окрашивание и метахромазию — красновато-розовое или красновато-фиолетовое окрашивание.

Примечания

Литература

• Окснер А. Н. Морфология, систематика и географическое распространение. — Л. : «Наука», 1974. — 284 с. — (Определитель лишайников СССР. Вып. 2).
• Дудка И. А., Вассер С. П., Элланская Э. А. и др. Методы экспериментальной микологии. Справочник. — Киев: «Наукова думка», 1982. — С. 59, 474—477.
• Вассер С. П. Флора грибов Украины. Агариковые грибы. — Киев: «Наукова думка», 1980. — С. 43—55.
• Змитрович И. В. . — М. — СПб.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. — С. —25. — (Определитель грибов России. Порядок афиллофоровые; Выпуск 3). — ISBN 978-5-87317-561-1 .