Interested Article - Геномная библиотека

Схема создания геномной библиотеки с помощью - вектора

Гено́мная библиоте́ка представляет собой набор ДНК всего генома одного организма. Эта ДНК хранится в популяции идентичных векторов , каждый из которых содержит различные вставки ДНК.

Создание геномной библиотеки

Для построения геномной библиотеки ДНК экстрагируют из клеток и затем расщепляют рестриктазой , чтобы разрезать ДНК на фрагменты определённого размера . Фрагменты затем встраивают в вектор с помощью фермента ДНК-лигазы . Далее вектор ДНК может быть встроен в организм-хозяин — обычно в популяцию кишечной палочки ( E. coli ) или дрожжей , где в каждой клетке содержатся копии вектора с одной, уникальной вставкой.

Хранение и области применения

Схема блоттинга колоний геномной библиотеки с последующей гибридизацией ДНК колоний и меченых ДНК-зондов

Ранняя модель робота для автоматизированного производства мембран (фильтров), содержащих ДНК клонов геномной библиотеки

Использование клетки хозяина для хранения вектора позволяет легко амплифициривать и находить определённые клоны из библиотеки для анализа. Геномную библиотеку можно хранить длительно (в замороженном состоянии). При необходимости отдельные бактериальные или дрожжевые клоны, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами или другими элементами генома, выделяют и размножают ( клонируют ). Клонированные таким способом участки генома выделяют из клеток и используют для решения различных теоретических и практических задач генетики , медицины (в том числе диагностики наследственных болезней ) и биотехнологии , а также для картирования геномов .

Скрининг (от англ. screening ) библиотеки, то есть поиск конкретного фрагмента ДНК среди сотен и тысяч других последовательностей, осуществляют методом ДНК-гибридизации при помощи ДНК-зондов . Если исследователь знает хотя бы небольшую последовательность нуклеотидов с искомого участка, он искусственно синтезирует комплементарную последовательность ( праймер длиной около 20 нуклеотидов) и метит её или радиоактивным изотопом , или флуоресцентной меткой. С чашки Петри с колониями посредством блоттинга делают реплику: прикладывают к чашке тонкую нитроцеллюлозную или иную мембрану, на которой остаётся отпечаток всех колоний. После этого осуществляют разрушение бактериальных клеток на отпечатке, освобождение ДНК от белков в щелочной среде и денатурацию ДНК до одноцепочечной молекулы. Далее обрабатывают все колонии зондом и смотрят, в какой из колоний зонд присоединился по принципу комплементарности. Эта колония и будет содержать нужный фрагмент ДНК.

Иногда исследователь не знает последовательности ДНК, которую ищет, но имеет последовательность аминокислот исследуемого белка. Поскольку каждой аминокислоте может соответствовать несколько триплетов нуклеотидов (от одного до шести), то и вероятные кодирующие ДНК могут быть разными. Тогда готовится смесь зондов, которые могут распознать предполагаемую последовательность.

Современные высокотехнологичные методики скринирования геномных библиотек (в частности, изготовленных с помощью - векторов ) основаны на применении роботизированного (автоматизированного) производства , в любом необходимом количестве копий, для хранения колоний (клонов), а также нитроцеллюлозных и нейлоновых мембран (фильтров), используемых непосредственно для гибридизации с ДНК-зондами. Дальнейшее увеличение эффективности скрининга при этом достигают за счёт применения в качестве ДНК-зондов так называемых проб overgos (от англ. over lapping oli gos — «перекрывающиеся олигонуклеотиды ») . Возможно также применение ПЦР для скрининга библиотек.

Ещё одной разновидностью геномной библиотеки является микросателлитная библиотека, клоны которой содержат тандемные повторы . Их секвенирование позволяет получать полиморфные ДНК-маркеры (микросателлитные локусы ) для различных генетических и геномных приложений .

См. также

Примечания

Lee M.‐K., Ren C. W., Yan B., Cox B., Zhang H.‐B., Romanov M. N., Sizemore F. G., Suchyta S. P., Peters E., Dodgson J. B. (англ.) // : журнал. — Oxford , UK : International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd , 2003. — Vol. 34, no. 2 . — P. 151—152. — ISSN . — doi : . — . 22 февраля 2015 года. (Дата обращения: 22 февраля 2015)
Сазанов А. А., Романов М. Н., Смирнов А. Ф. // Генетика : журнал. — М. : Наука , 2005. — Т. 41 , № 5 . — С. 581—589 . — ISSN . — . 17 марта 2015 года. (Дата обращения: 17 марта 2015)
↑ Song B.-K., Nadarajah K., Romanov M. N. Ratnam W. (англ.) // Cellular & Molecular Biology Letters : журнал. — Wrocław , Poland ; Berlin , Heidelberg , Germany : Cellular & Molecular Biology Letters, University of Wrocław , Ministry of Science and Higher Education, Poland ; Springer Science+Business Media , 2005. — Vol. 10, no. 3 . — P. 425—437. — ISSN . — . 15 марта 2015 года. (Дата обращения: 15 марта 2015)
Romanov M. N., Koriabine M., Nefedov M., de Jong P. J., Ryder O. A. (англ.) // : журнал. — Amsterdam , The Netherlands : Academic Press Inc , Elsevier Science B. V. , 2006. — Vol. 88, no. 6 . — P. 711—718. — ISSN . — doi : . — . 18 февраля 2015 года. (Дата обращения: 18 февраля 2015)
Romanov M. N., Dodgson J. B., Gonser R. A., Tuttle E. M. (англ.) // : журнал. — London , UK: , 2011. — Vol. 4. — P. 211. — ISSN . — doi : . — . 2 апреля 2015 года. (Дата обращения: 2 марта 2015)
Romanov M. N. , Dodgson J. B. (англ.) // Animal Genetics : журнал. — Oxford, UK: International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd, 2006. — Vol. 37, no. 4 . — P. 397—399. — ISSN . — doi : . — . 15 февраля 2015 года. (Дата обращения: 15 февраля 2015)
Romanov M. N. , Jones K. C. , Chemnick L. G. , Stremel-Mork E. , Otten C. , Da Y. , Akhunov E. D. , Ryder O. A. (2009-01-10). . . San Diego , CA , USA : Scherago International. p. 107. Abstract P517. Архивировано из 23 января 2012 . Дата обращения: 10 января 2009 . {{ cite conference }} : Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) ( ссылка ) (англ.)

Литература

Щелкунов С. Н. . — 2-е изд. — Новосибирск : Сибирское университетское издательство, 2004. — 496 с. — 2000 экз. — ISBN 5940870988 . (Дата обращения: 3 марта 2020) от 3 марта 2020 на Wayback Machine