Interested Article - Глутаминсинтетаза

keira
  • 2020-08-29
  • 2

Глутаминсинтетаза,
каталитический домен
12-субъединичный фермент глутаминсинтетаза из Salmonella typhimurium.[2]
12-субъединичный фермент глутаминсинтетаза из Salmonella typhimurium .
Идентификаторы
Символ Gln-synt_C
Pfam
Pfam clan
Доступные структуры белков
Pfam
PDB ; ;

Глутаминсинтетаза , также L-глутамат-аммиак лигаза (сокр. ГС ) — фермент (КФ ) из класса синтетаз (лигаз), принимает участие в обезвреживании свободного аммиака в тканях. Данный фермент катализирует в присутствии двухвалентных ионов (Mg 2+ или Mn 2+ ) реакцию образования аминокислоты L-глутамина , посредством присоединения к L-глутамату молекул аммиака NH 3 ( in vivo свободный аммиак ионизирован и представляет собой катион аммония — NH 4 + ), с использованием энергии гидролиза макроэргических связей АТФ . Реакция имеет следующий вид:

L-глутамат + ATФ + NH 3 → L-глутамин + АДФ + Ф i .

Glutamine synthetase reaction.
Реакция, катализируемая глутаминсинтетазой.

Глутаминсинтетаза использует в качестве субстрата аммиак (точнее ионы аммония), образующийся в результате восстановления нитратов , расщепления аминокислот и фотодыхания (у растений). Амидная группа глутамата является источником азота для синтеза метаболитов глутаминового пути (например, для синтеза пиримидиновых азотистых оснований).

Конкуренция между ионом аммония и водой, их сродство к связыванию и концентрация иона аммония влияют на синтез глутамина и его гидролиз. Глутамин образуется, если ион аммония атакует ацилфосфатный промежуточный продукт, в то же время, если вода атакует молекулы интермедиата, то происходит образование глутамата . Ион аммония связывается с ГС сильнее, чем вода, из-за электростатических сил между катионом и отрицательно заряженным карманом . Другая возможная реакция заключается в том, что при связывании гидроксиламина NH 2 OH с ГС, а не с ионом NH 4 + , образуется γ-глутамилгидроксамат .

Глутаминсинтетаза широко распространена в живых организмах и встречается как у прокариот , так и у эукариот . Прокариотические типы глутаминсинтетазы локализованы в цитозоле клеток, в то же время эукариотические типы фермента могут располагаться как в цитозоле, так и в органеллах (в митохондриях или хлоропластах). Несмотря на то, что данный фермент обнаружен в матриксе митохондрий , ГС — не является митохондриальным белком, он транслоцируется в матрикс обычно из цитозоля .

У человека ГС кодируется геном — , который локализован на q-плече 1-ой хромосомы . Длина полипептидной цепи белка составляет 373 аминокислотных остатков, его молекулярная масса — 42064 Да . Белок имеет 2 домена : первый домен — некаталитический (β-grasp), включает аминокислоты 24-106, второй — каталитический, включает в себя аминокислоты 113-373.

Структура

Глутаминсинтетаза представляет собой олигомерный белок и может состоять из 8, 10 или 12 идентичных субъединиц, разделённых на два обращённых друг к другу кольца . Бактериальные ГС представляют собой додекамеры (12-меры) с 12 активными центрами между каждым мономером . Каждый активный сайт создаёт «туннель», который является местом расположения трёх различных сайтов связывания субстрата: нуклеотида, иона аммония (NH 4 + ) и аминокислоты . Молекулы АТФ связываются с верхушкой двойной воронки, которая открывается на внешнюю поверхность ГС. Глутамат связывается в нижней части активного сайта . В середине двойной воронки имеются два места связывания двухвалентных катионов (Mn +2 или Mg +2 ). Один сайт связывания катионов участвует в фосфорильном переносе АТФ на глутамат, а второй стабилизирует активность ГС и помогает связыванию глутамата .

Два кольца ГС удерживаются вместе за счёт водородных связей и гидрофобных взаимодействий . В своей последовательности каждая субъединица имеет С-конец и N-конец. С-конец (спиральный ремешок) стабилизирует структуру глутаминсинтетазы, встраиваясь в гидрофобную область субъединицы поперёк другого кольца. N-конец подвергается воздействию растворителя. Кроме того, центральный канал формируется за счёт шести четырёхцепочечных β-листов , состоящих из антипараллельных петель двенадцати субъединиц .

Два представления молекулы глутаминсинтетазы (12-мер, вид сверху и сбоку). Идентификатор PDB: 1FPY.

Механизм катализа

Фермент катализирует АТФ-зависимую конденсацию глутамата с аммиаком с образованием глутамина . Гидролиз молекул АТФ запускает первый этап двухступенчатого согласованного механизма . АТФ фосфорилирует глутамат с образованием АДФ и промежуточного ацилфосфата — γ-глутамилфосфата, который реагирует с аммиаком, образуя глутамин и неорганический фосфат . АДФ и Ф i не диссоциируют до тех пор, пока происходит связывания аммиака и не высвобождается глутамин .

АТФ сначала связывается с верхней частью активного сайта, расположенного рядом с сайтом связывания катионов, тогда как глутамат связывается со вторым сайтом связывания катионов в нижней части активного сайта . Присутствие молекул АДФ вызывает конформационный сдвиг в молекуле фермента, который стабилизирует фрагмент γ-глутамилфосфата. Аммоний прочно связывается с ГС только в том случае, если присутствует промежуточный ацилфосфат. Аммоний, а не аммиак, связывается с ГС, поскольку сайт связывания полярен и подвергается воздействию растворителя . На втором этапе депротонирование аммония позволяет аммиаку атаковать интермедиат из близлежащего участка с образованием глутамина . Фосфат (Ф i ) уходит через верхнюю часть активного центра, а глутамин — через нижнюю часть (между двумя кольцами) .

Биологические функции

ГС локализована преимущественно в головном мозге , почках и печени . Глутаминсинтетаза в головном мозге участвует в метаболической регуляции глутамата, детоксикации аммиака (который очень токсичен для ЦНС), ассимиляции аммиака, рециклизации нейротрансмиттеров и прекращении сигналов нейромедиаторов . ГС в головном мозге обнаруживается преимущественно в астроцитах . Астроциты защищают нейроны от эксайтотоксичности , поглощая избыток аммиака и глутамата. В гипераммониемической среде (высокие концентрации аммиака) возникает отёк астроглии . К проблеме набухания астроглии подошли с разных точек зрения. Одно исследование показывает, что происходят морфологические изменения, которые увеличивают экспрессию ГС в глутаматергических областях или другие адаптации, которые снижают высокие уровни глутамата и аммиака . Другая точка зрения заключается в том, что набухание астроцитов происходит из-за накопления глутамина. Чтобы предотвратить повышение уровня коркового глутамата и содержания кортикальной воды, было проведено исследование по предотвращению активности ГС у крыс с помощью ингибитора — (MSO) .

Классы

По-видимому, существует три различных класса ГС:

  • Ферменты класса I (GSI) специфичны для прокариот и представляют собой олигомеры из 12 идентичных субъединиц . Активность фермента GSI-типа контролируется аденилированием остатка тирозина. Аденилированный фермент неактивен .
  • Ферменты класса II (GSII) обнаружены у эукариот и бактерий, принадлежащих к семействам , и (эти бактерии также имеют GS класса I). GSII являются декамерами, состоящими из 10 идентичных субъединиц PDB .

Растения имеют два или более изофермента GSII, один из изоферментов транслоцируется в хлоропласт . Другая форма — цитозольная. Цитозольная трансляция гена GS регулируется его 5'-нетранслируемой областью (5'-UTR), в то время как его 3'-UTR играет роль в смене транскриптов .

  • Ферменты класса III (GSIII) в настоящее время обнаружены только у и . Это додекамер (12-мер) с двойным кольцом из одинаковых цепочек . Глутаминсинтетазы данного класса намного крупнее (около 700 аминокислот), чем ферменты GSI (от 450 до 470 аминокислот) или GSII (от 350 до 420 аминокислот).

Хотя три класса глутаминсинтетаз явно структурно связаны, их сходство последовательностей не столь велико.

Регуляция и ингибирование

ГС подвержена обратимой ковалентной модификации. Аминокислотный остаток тирозина Tyr-397 из всех 12 субъединиц может подвергаться аденилированию или деаденилированию аденилаттрансферазой (AT), бифункциональным регуляторным ферментом . Аденилирование — это посттрансляционная модификация белка, включающая ковалентное присоединение молекул АМФ к боковой цепи белка. Для каждого аденилирования требуется молекула АТФ, а для полного ингибирования ГС требуется 12 АТФ. Деаденилирование с помощью АТ включает фосфоролитическое удаление Tyr-связанных аденилильных групп в виде молекул АДФ. На активность АТ влияет связанный с ней регуляторный белок: P II , тример с молекулярной массой 44 кДа . P II также подвергается посттрансляционной модификации уридилилтрансферазой, поэтому P II имеет две формы. Состояние белка P II влияет на активность аденилаттрансферазы. Если P II не уридилирован, то он примет форму P IIA . Комплекс AT:P IIA деактивирует ГС путём аденилирования. Если молекулы P II уридилированы, то они примут форму P IID . Комплекс AT:P IID активирует ГС путём деаденилирования . Комплексы AT:P IIA и AT:P IID реципрокно (взаимно) аллостерически регулируются α-кетоглутаратом (α-KG) и глутамином (Gln). Gln активирует активность AT:P IIA и ингибирует AT:P IID , что приводит к аденилированию и последующей дезактивации ГС. Более того, Gln выступает за преобразование P IID в P IIA . Эффекты α-KG на комплексы противоположны . У большинства грамотрицательных бактерий глутаминсинтетаза может модифицироваться путём аденилирования (некоторые цианобактерии и зелёные водоросли или исключения) .

Ингибирование ГС в основном сосредоточено на связывании сайтов амино лигандов . Другие ингибиторы являются результатом метаболизма глутамина: триптофан , гистидин , карбамоилфосфат , глюкозамин-6-фосфат, цитидинтрифосфат (ЦТФ) и аденозинмонофосфат (АМФ) . Другими ингибиторами/регуляторами являются аминокислоты глицин и аланин. Аланин, глицин и серин связываются с участком глутаматного субстрата. ГДФ, АМФ, АДФ связываются с сайтом АТФ . L-серин , L-аланин и глицин связываются с сайтом L-глутамата в неаденилированной глутаминсинтетазе. Четыре аминокислоты связываются с этим участком своими общими атомами, “главной цепью” аминокислот . Глутамат — ещё один продукт метаболизма глутамина; однако глутамат является субстратом для ингибирования ГС, который действует как регулятор ГС. Каждый ингибитор может снижать активность фермента; как только все конечные метаболиты глутамина связываются с ферментом, его активность почти полностью ингибируется . Множество ингибирующих входных сигналов позволяет осуществлять тонкую регуляцию ГС, отражая уровень азота в организме.

Регуляция обратной связи определяет разницу между двумя эукариотическими типами ГС: мозговым типом (ткани мозга) и немозговым (все остальные ткани). Немозговой тип ГС реагирует на подавление обратной связи конечным продуктом, в то время как мозговой тип ГС этого не делает . Высокие концентрации глутамин-зависимых метаболитов должны подавлять активность ГС, в то время как низкие концентрации должны активировать активность ГС.

MSO.
Метионинсульфоксимин действует как ингибитор сайта связывания глутамата.

Ингибиторы:

  • (МСО, MSO): МСО является ингибитором, который связывается с глутаматным участком. Связанный с глутаминсинтетазой, MSO фосфорилируется АТФ, что приводит к необратимому нековалентному ингибированию ГС. МСО, имеющий конфигурацию S-изомера является более сильным ингибитором. Поступление глутамата в активный центр блокируется стабилизацией гибкой петли в активном центре с помощью МСО .
  • (PPT, глуфосинат): Фосфинотрицин является ингибитором, который связывается с глутаматным участком. Глуфосинат используется в качестве гербицида. Обработанные глуфосинатом растения погибают из-за накопления аммиака и прекращения фотосинтеза .
  • Сегодня доступно множество синтетических ингибиторов .

Исследования на E. coli показали, что глутаминсинтетаза регулируется посредством экспрессии генов. Ген, кодирующий субъединицу ГС, обозначается glnA . Транскрипция glnA зависит от NR I ( специфического усилителя транскрипции ). Активная транскрипция происходит, если NR I находится в своей фосфорилированной форме, обозначаемой NR I -P. Фосфорилирование NR I катализируется NR II , протеинкиназой. Если NR II образует комплекс с P IIA , то он будет функционировать как фосфатаза, и NR I -P преобразуется обратно в NR I . В этом случае транскрипция glnA прекращается .

ГС подчиняется совершенно иным регуляторным механизмам у цианобактерий . Вместо обычной двухкомпонентной системы NtrC-NtrB , цианобактерии содержат регулятор транскрипции NtcA, который ограничен этой кладой и контролирует экспрессию ГС и множества генов, участвующих в метаболизме азота . Более того, глутаминсинтетазы у цианобактерий ковалентно не модифицируется чтобы повысить чувствительность к ингибированию по принципу обратной связи . Вместо этого, ГС у цианобактерий ингибируются небольшими белками, которые называются ГС-инактивирующими факторами (IFs), транскрипция которых отрицательно регулируется NtcA . Кроме того, эти инактивирующие факторы регулируются различными некодирующими РНК : sRNA NsiR4 взаимодействует с 5'-UTR мРНК фактора инактивации ГС IF7 (мРНК gifA ) и снижает его экспрессию. Экспрессия NsiR4 находится под положительным контролем транскрипционного фактора, отвечающего за регуляцию азота, NtcA . Кроме того, экспрессия фактора, инактивирующего ГС, IF17 контролируется глутамин-связывающим рибопереключателем .

Примечания

  1. PDB ; Gill HS, Eisenberg D (February 2001). "The crystal structure of phosphinothricin in the active site of glutamine synthetase illuminates the mechanism of enzymatic inhibition". Biochemistry . 40 (7): 1903—12. doi : . PMID .
  2. PDB ; Yamashita MM, Almassy RJ, Janson CA, Cascio D, Eisenberg D (October 1989). "Refined atomic model of glutamine synthetase at 3.5 A resolution". J. Biol. Chem . 264 (30): 17681—90. doi : . PMID .
  3. Eisenberg D, Almassy RJ, Janson CA, Chapman MS, Suh SW, Cascio D, Smith WW (1987). "Some evolutionary relationships of the primary biological catalysts glutamine synthetase and RuBisCO". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol . 52 : 483—90. doi : . PMID .
  4. ↑ Liaw SH, Kuo I, Eisenberg D (Nov 1995). . Protein Sci . 4 (11): 2358—65. doi : . PMC . PMID .
  5. ↑ Liaw SH, Pan C, Eisenberg D (Jun 1993). . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 90 (11): 4996—5000. Bibcode : . doi : . PMC . PMID .
  6. ↑ Eisenberg D, Gill HS, Pfluegl GM, Rotstein SH (Mar 2000). . Biochim Biophys Acta . 1477 (1—2): 122—45. doi : . PMID .
  7. ↑ Liaw SH, Eisenberg D (Jan 1994). "Structural model for the reaction mechanism of glutamine synthetase, based on five crystal structures of enzyme-substrate complexes". Biochemistry . 33 (3): 675—81. doi : . PMID .
  8. (англ.) .
  9. ↑ . — 6th. — San Francisco : W.H. Freeman, 2007. — P. –706. — ISBN 978-0-7167-8724-2 .
  10. Goodsell DS. . Molecule of the month . RCSB Protein Data Bank (июнь 2002). Дата обращения: 8 мая 2010.
  11. ↑ Krajewski WW, Collins R, Holmberg-Schiavone L, Jones TA, Karlberg T, Mowbray SL (Jan 2008). . J Mol Biol . 375 (1): 317—28. doi : . PMID .
  12. Ginsburg A, Yeh J, Hennig SB, Denton MD (Feb 1970). "Some effects of adenylylation on the biosynthetic properties of the glutamine synthetase from Escherichia coli". Biochemistry . 9 (3): 633—49. doi : . PMID .
  13. Hunt JB, Smyrniotis PZ, Ginsburg A, Stadtman ER (Jan 1975). "Metal ion requirement by glutamine synthetase of Escherichia coli in catalysis of gamma-glutamyl transfer". Arch Biochem Biophys . 166 (1): 102—24. doi : . PMID .
  14. Goodsell, DS. . RCSB Protein Data Bank (июнь 2002). Дата обращения: 8 мая 2010.
  15. ↑ Suarez I, Bodega G, Fernandez B (Aug–Sep 2002). "Glutamine synthetase in brain: effect of ammonia". Neurochem. Int . 41 (2—3): 123—42. doi : . PMID . S2CID .
  16. Venkatesh K, Srikanth L, Vengamma B, Chandrasekhar C, Sanjeevkumar A, Mouleshwara Prasad BC, Sarma PV (2013). . Neurol India . 61 (4): 383—8. doi : . PMID . {{ cite journal }} : Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) ( ссылка )
  17. ↑ Willard-Mack CL, Koehler RC, Hirata T, et al. (March 1996). "Inhibition of glutamine synthetase reduces ammonia-induced astrocyte swelling in rat". Neuroscience . 71 (2): 589—99. doi : . PMID . S2CID .
  18. Tanigami H, Rebel A, Martin LJ, Chen TY, Brusilow SW, Traystman RJ, Koehler RC (2005). . Neuroscience . 131 (2): 437—49. doi : . PMC . PMID .
  19. Kumada Y, Benson DR, Hillemann D, Hosted TJ, Rochefort DA, Thompson CJ, Wohlleben W, Tateno Y (April 1993). . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 90 (7): 3009—13. Bibcode : . doi : . PMC . PMID .
  20. Shatters RG, Kahn ML (November 1989). "Glutamine synthetase II in Rhizobium: reexamination of the proposed horizontal transfer of DNA from eukaryotes to prokaryotes". J. Mol. Evol . 29 (5): 422—8. Bibcode : . doi : . PMID . S2CID .
  21. Brown JR, Masuchi Y, Robb FT, Doolittle WF (June 1994). "Evolutionary relationships of bacterial and archaeal glutamine synthetase genes". J. Mol. Evol . 38 (6): 566—76. Bibcode : . doi : . PMID . S2CID .
  22. . Дата обращения: 31 марта 2009. Архивировано из 17 декабря 2008 года.
  24. Ortega JL, Wilson OL, Sengupta-Gopalan C (December 2012). . Molecular Genetics and Genomics . 287 (11—12): 881—93. doi : . PMC . PMID .
  25. van Rooyen JM, Abratt VR, Sewell BT (August 2006). "Three-dimensional structure of a type III glutamine synthetase by single-particle reconstruction". J. Mol. Biol . 361 (4): 796—810. doi : . : . PMID .
  26. ↑ Garrett, Grisham. Biochemistry. — 6th. — United States of America : Cengage Learning, 2017. — P. 886–889. — ISBN 978-1-305-57720-6 .
  27. Ivanovsky RN, Khatipov EA (1994). . FEMS Microbiology Letters . 122 (1—2): 115—119. doi : .
  28. Krishnan IS, Singhal RK, Dua RD (Apr 1986). "Purification and characterization of glutamine synthetase from Clostridium pasteurianum". Biochemistry . 25 (7): 1589—99. doi : . PMID .
  29. Bolay, Paul; Muro-Pastor, M.; Florencio, Francisco; Klähn, Stephan (27 October 2018). . Life . 8 (4): 52. doi : . PMC . PMID .
  30. Merrick MJ, Edwards RA (December 1995). . Microbiological Reviews . 59 (4): 604—22. doi : . PMC . PMID .
  31. ↑ Fisher R, Tuli R, Haselkorn R (June 1981). . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 78 (6): 3393—7. Bibcode : . doi : . PMC . PMID .
  32. Vega-Palas MA, Flores E, Herrero A (July 1992). "NtcA, a global nitrogen regulator from the cyanobacterium Synechococcus that belongs to the Crp family of bacterial regulators". Molecular Microbiology . 6 (13): 1853—9. doi : . PMID . S2CID .
  33. Reyes JC, Muro-Pastor MI, Florencio FJ (April 1997). . Journal of Bacteriology . 179 (8): 2678—89. doi : . PMC . PMID .
  34. García-Domínguez M, Reyes JC, Florencio FJ (June 1999). . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 96 (13): 7161—6. Bibcode : . doi : . PMC . PMID .
  35. García-Domínguez M, Reyes JC, Florencio FJ (March 2000). "NtcA represses transcription of gifA and gifB, genes that encode inhibitors of glutamine synthetase type I from Synechocystis sp. PCC 6803". Molecular Microbiology . 35 (5): 1192—201. doi : . PMID . S2CID .
  36. Klähn S, Schaal C, Georg J, Baumgartner D, Knippen G, Hagemann M, Muro-Pastor AM, Hess WR (November 2015). . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 112 (45): E6243-52. Bibcode : . doi : . PMC . PMID .
  37. Klähn S, Bolay P, Wright PR, Atilho RM, Brewer KI, Hagemann M, Breaker RR, Hess WR (August 2018). . Nucleic Acids Research . 46 (19): 10082—10094. doi : . PMC . PMID .
Источник —

keira
  • 2020-08-29
  • 2

Same as Глутаминсинтетаза

The title for the last searches