А́нти-CRISPR ( англ. Anti-CRISPR ) — система белков , благодаря которой бактериофаги (как бактерий , так и архей ) противостоят разрушительному действию систем CRISPR /Cas. Системы анти-CRISPR описаны у многих бактериофагов. Белки этих систем в большинстве случаев мешают процессу узнавания мишени и работе белков Cas. Системы анти-CRISPR могут иметь биотехнологическое значение, поскольку могут применяться для тонкой регуляции редактирования генома с помощью технологии CRISPR/ Cas9 .

История изучения

До открытия анти-CRISPR был известен только один способ, с помощью которого фагам удается избежать разрушения системой CRISPR/Cas, — приобретение точечных мутаций . Они практически не сказываются на жизнеспособности фага, зато нарушают комплементарность спаривания фаговой ДНК с направляющей РНК , из-за чего система CRISPR/Cas не может распознать вирусный генетический материал . Однако микроорганизмы быстро находят способ обойти эту защиту, вставляя в свой геном новые фрагменты чужеродной ДНК. Первые белки анти-CRISPR открыли в 2013 году у нескольких родственных фагов, поражающих бактерию Pseudomonas aeruginosa . Теоретически, если фаг встроится в геном бактерии, имеющей активную систему CRISPR/Cas, то бактерия погибнет, поскольку разрежет собственный геном. Однако встраивание некоторых фагов в геном бактерий с активной CRISPR/Cas не приводило к гибели клеток. При сравнении геномов фагов, вызывающих гибель бактериальных клеток, и фагов, которые не приводят к смерти клеток, оказалось, что у последних имеется особый локус , содержащий десять совершенно различных и очень коротких генов (длиной 150—450 нуклеотидов ). Выяснилось, что белковые продукты пяти из них (acrF1—acrF5) нарушают работу системы CRISPR/Cas типа I-F у P. aeruginosa , а ещё четыре (acrE1–acrE4) блокируют систему типа I-E у той же бактерии. Гены анти-CRISPR были выявлены не только у фагов P. aeruginosa , но также в плазмидах и конъюгативных островках этой бактерии .

Аминокислотные последовательности белков анти-CRISPR сильно различаются и не имеют какого-то общего мотива , который бы помог идентифицировать аналогичные гены в геномах других бактериофагов при помощи стандартных методов биоинформатики . Однако оказалось, что окружение генов анти-CRISPR очень похоже: у всех них после собственно генов анти-CRISPR находится ген, кодирующий транскрипционный фактор Aca1 (от англ. anti-CRISPR associated 1 ) . Фаги, не имеющие генов анти-CRISPR, не имеют и гена aca1 . Более того, гены анти-CRISPR и ген aca1 образуют единый оперон , а белок Aca1, по-видимому, регулирует экспрессию анти-CRISPR сообразно стадии инфекционного цикла фага. Белок Aca1 имеет структурный мотив «спираль—поворот—спираль» , часто встречающийся среди транскрипционных факторов. Чтобы установить, кодирует ли исследуемый участок генома бактериофага белки анти-CRISPR, учёные проверяли наличие сразу за ним гена, кодирующего белок с мотивом «спираль—поворот—спираль». С помощью такого подхода белки анти-CRISPR, действующие против систем I типа, открыли у бактериофагов разнообразных протеобактерий . Тот же подход привел к открытию анти-CRISPR, нарушающих работу систем II типа .

Недавно создали базу данных белков анти-CRISPR — antiCRISPRdb, — в которой любой желающий может найти известную информацию об интересующем белке анти-CRISPR .

Механизм действия

Сегодня известно 22 семейства белков анти-CRISPR. Их объединяет лишь малый размер (от 50 до 150 аминокислотных остатков), они не имеют какого-либо общего мотива и ни один из них не похож на какой-либо белок с известной функцией. Поэтому предположить механизм действия анти-CRISPR с помощью биоинформатики оказалось невозможным. Пока удалось установить механизм действия шести белков анти-CRISPR с использованием генетического , биохимического и структурного подходов. Теоретически, белки анти-CRISPR могут влиять на работу CRISPR/Cas на нескольких этапах . Они могут:

• препятствовать вставке новых фрагментов чужеродной ДНК в геном микроорганизма;
• нарушать синтез белков Cas;
• блокировать образование направляющей РНК ;
• препятствовать сборке активного комплекса белков Cas с РНК;
• мешать связыванию комплекса с чужеродной ДНК;
• блокировать способность комплекса к разрезанию ДНК-мишени.

На данный момент описано действие белков анти-CRISPR по двум последним сценариям. Например, белки AcrF1 и AcrF2 присоединяются к комплексу белков Cas и РНК, не давая ему связываться с чужеродной ДНК. Белок AcrF3 взаимодействует с белком Cas3, обладающим хеликазной и нуклеазной активностями, и не дает ему присоединиться к комплексу других белков Cas и РНК, уже связавшему ДНК-мишень. AcrIIC1 связывается с нуклеазным доменом белка Cas9 (единственного белка Cas в системах II типа), не давая ему разрезать ДНК .

Некоторые белки анти-CRISPR активны против нескольких систем CRISPR/Cas. Например, белки анти-CRISPR, действующие против систем типа II-A, подавляют работу гомологичных белков Cas9, аминокислотные последовательности которых схожи лишь на 53 % .

Эволюционное значение

Недавние исследования показали, что одних только точечных мутаций бактериофагам недостаточно, чтобы избежать действия CRISPR/Cas. Фагу необходимо иметь, по крайней мере, один ген анти-CRISPR, чтобы избежать полного уничтожения при совместном культивировании с бактериями с активными системами CRISPR/Cas. По-видимому, столь сильный отбор вносит свой вклад в разнообразие аминокислотных последовательностей и механизмов действия анти-CRISPR. Белки анти-CRISPR служат важными факторами эволюции микроорганизмов. Так, встраивание мобильных генетических элементов с генами таких белков в геном бактерии приводит к постоянной инактивации систем CRISPR/Cas из-за стабильной экспрессии анти-CRISPR. Находящаяся в таком состоянии клетка не может сопротивляться проникновению других мобильных генетических элементов и, следовательно, горизонтальному переносу генов . При долговременной инактивации CRISPR/Cas бактерия может совсем потерять гены cas или накопить мутации , делающие их нефункциональными. Биоинформатический анализ систем CRISPR/Cas различных бактерий показал, что около 12 % из них нефункциональны из-за утраты генов cas или вредных мутаций в них. Экспериментально продемонстрировали, что в условиях, когда приобретение чужеродной ДНК выгодно, бактерии могут вообще целиком терять систему CRISPR/Cas .

Биотехнологическое значение

На данный момент известны белки анти-CRISPR, подавляющие работу Cas9 бактерии Streptococcus pyogenes (именно этот фермент чаще всего используют для редактирования геномов с помощью систем CRISPR/Cas). Более того, два из них делают это в клетках человека , блокируя редактирование генома. Поэтому с помощью белков анти-CRISPR можно регулировать редактирование генома посредством CRISPR/Cas, например, оставляя систему активной только в некоторых тканях и органах , только на определенных этапах эмбрионального развития или только в определенные моменты клеточного цикла . Кроме того, применение анти-CRISPR поможет уменьшить частоту внеплановых мутаций, вносимых Cas9. Обычно Cas9 активен до тех пор, пока клетка не разрушит или фермент, или направляющую РНК, и слишком длительный период активности Cas9 часто приводит к мутациям вне гена-мишени. Многие бактериальные патогены человека имеют активные системы CRISPR/Cas, и применение белков анти-CRISPR может значительно повысить эффективность фаговой терапии . Таким образом, в будущем белки анти-CRISPR могут найти широкое применение в биотехнологии, генной инженерии и медицине .

Примечания

Ссылки

• Елизавета Минина. (неопр.) .