Interested Article - Количественный анализ нуклеиновых кислот

Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.

Спектрофотометрический анализ

Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет . В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.

При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл) ⁻¹ см ⁻¹ , для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл) ⁻¹ см ⁻¹ , для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл) ⁻¹ см ⁻¹ и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл) ⁻¹ см ⁻¹ ). Отсюда, оптическая плотность ( англ. OD, optical density ) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD. Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего соседства.

Коэффициенты пересчета

Тип нуклеиновой кислоты	Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A ₂₆₀
dsDNA (двуцепочечная ДНК)	50
ssDNA (одноцепочечная ДНК)	37
ssRNA (одноцепочечная РНК)	40

Кюветы для анализа

Для определения концентрации образца найденную в стандартной кювете с величиной оптического пути 10 мм оптическую плотность необходимо разделить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.

Кюветы малого объема

Для многих биологических исследований ( ДНК-микрочип , количественная ПЦР ) требуется качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Чистота образца

Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A _260/280 ) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A _260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A _260/280 около 2.

Примеси белков и отношение 260:280

Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, так как ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нм . Однако влияние примесных белков на определение концентрации нуклеиновых кислот невелико — лишь при значительной концентрации белка соотношение 260:280 сдвигается существенно .

Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот:

% белка	% нуклеиновой кислоты	отношение 260:280
100	0	0,57
95	5	1,06
90	10	1,32
70	30	1,73

Отношение 260:230 имеет меньшую чувствительность при определении примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты:

% нуклеиновой кислоты	% белка	отношение 260:230
100	0	2,00
95	5	1,99
90	10	1,98
70	30	1,94

Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Белковое загрязнение в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определено по соотношению 260:230.

Другие загрязнения

Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A _260/280 около 1,2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A _260/280 около 2 . Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
Поглощение на длине волны 230 нм может быть вызвано загрязнениями , тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A _260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A _260/230 около 1,8.
Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank) либо быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.

Определение количества молекул ДНК или РНК с конкретными последовательностями нуклеотидов с помощью технологии SlipChip

Для диагностических целей часто надо определить количество той или иной ДНК или РНК. Разработаны высокочувствительные методы определения ДНК и РНК в микрообъёмах образцов — каплях не превышающих несколько пиколитров. Для этого используются микрожидкостные устройства для ПЦР с одной копии нуклеиновой кислоты .

Примечания

↑ Sambrook and Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (неопр.) . — 3rd. — (англ.) ( , 2001. — ISBN 978-087969577-4 .
Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids (англ.) // Biophys. Chem. : journal. — 2008. — Vol. 133 , no. 1—3 . — P. 66—70 . — doi : . — .
Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory,
Sambrook and Russell cites the original paper: Warburg, O. and Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase (нем.) // (англ.) ( : magazin. — 1942. — Bd. 310 . — S. 384—421 . )
Glasel J. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios (англ.) // (англ.) ( : journal. — 1995. — Vol. 18 , no. 1 . — P. 62—63 . — . )
. Bioteachnology.com (13 января 2010). Дата обращения: 12 марта 2010. 6 сентября 2012 года.
Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., & Ismagilov, R. F. (2010). ]. Lab on a Chip, 10(20), 2666—2672. doi : PMC
Jesus Rodriguez-Manzano, Mikhail A. Karymov, Stefano Begolo, David A. Selck, Dmitriy V. Zhukov, Erik Jue, Rustem F. Ismagilov. от 10 мая 2017 на Wayback Machine . ACS Nano, 2016; doi :
Ahrberg, C. D., Ilic, B. R., Manz, A., & Neužil, P. (2016). от 4 мая 2016 на Wayback Machine Lab on a Chip., 16, 586—592 doi : PMID PMC Available on 2017-01-26
Zhao Li, Yong Liu, Qingquan Wei, Yuanjie Liu, Wenwen Liu, Xuelian Zhang, and Yude Yu1 (2016). . PLoS One.; 11(4): e0153359 doi : PMC