Interested Article - Бисульфитное секвенирование

elizabeth
  • 2021-11-11
  • 2

Бисульфи́тное секвени́рование — общее название группы методов, направленных на изучение паттерна метилирования ДНК посредством обработки её бисульфитом .

Метилирование — первое открытое эпигенетическое маркирование. Оно влияет на уровень экспрессии генов , подавляя транскрипционную активность. Кроме того, во многих случаях метилирование наследуемо , что придает дополнительный интерес его исследованию.

Бисульфит действует на одноцепочечную ДНК , превращая цитозин в урацил . Если же этот цитозин метилирован, то есть к его пятому атому углерода присоединена метильная группа, то такой цитозин не подвергается превращению. Таким образом, бисульфит изменяет последовательность ДНК в зависимости от её паттерна метилирования, и после его воздействия можно установить, какие CpG-динуклеотиды были метилированы, сравнив измененную последовательность с исходной.

Методы

Методы анализа метилирования ДНК. После бисульфитной конверсии геномная ДНК амплифицируется при помощи ПЦР, которая не различает метилированные и неметилированные последовательности. Для разделения после бисульфитной конверсии в таком случае применяют различные методы.

Описанные ниже методы используют секвенирование обработанных бисульфитом участков ДНК для определения паттерна метилирования. Существуют также методы, не основанные на секвенировании, например, комбинированный бисульфитный рестриктационный анализ ( ) и иммунопреципитация метилированной ДНК ( ). Задачи изучения паттернов метилирования могут состоять как в исследовании метилирования конкретного цитозина, так и в определении доли метилированных цитозинов на каком-то участке ДНК, или даже по всему геному в целом. Из приводимых далее методов некоторые больше приспособлены для изучения конкретных сайтов метилирования, другие же — для изучения метилирования на более высоких уровнях. В идеале необходимо определять метилирование каждого аллеля . Описанию методов бисульфитного секвенирования посвящены несколько обзоров .

Прямое секвенирование

Первый метод бисульфитного секвенирования описан в 1992 году . Для определения паттерна метилирования использовали ПЦР, праймеры для которой были специфичными как к изменённой, так и к неизменённой бисульфитом ДНК, то есть они не содержали цитозинов, входящих в . Для праймеров использовали участки, близкие к интересующему сайту метилирования, но не содержащие его. В случае, когда цитозин не был метилирован, в амплифицированной последовательности обнаруживался тимин ( урацил ), а в синтезированной комплементарной последовательности — аденин . Если цитозин был метилирован, то в амплифицированной последовательности он и остался, а в комплементарной синтезировался гуанин . Такой метод очень трудозатратен, поскольку требует клонирования продуктов ПЦР для достижения необходимой чувствительности. Эту же проблему можно решить при помощи .

Пиросеквенирование

В пиросеквенировании используют ПЦР с праймерами, амплифицирующими как изменённую, так и не изменённую бисульфитом ДНК. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в амплифицируемой последовательности определяется по соотношению количества нуклеотидов А и Г в синтезируемой комплементарной последовательности .

Дальнейшее усовершенствование этого метода заключается в использовании аллель -специфических праймеров с однонуклеотидными полиморфизмами , позволяющих исследовать паттерны метилирования по отдельности в отцовских и материнских аллелях, что особенно полезно при изучении геномного импринтинга .

Чувствительный к метилировании анализ одноцепочечных конформаций

Этот метод основан на методе анализа ( англ. single-strand conformation polymorphism analysis, SSCA ). SSCA был разработан для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) . Фрагменты ДНК одинаковой длины, но разной нуклеотидной последовательности, с разной скоростью перемещаются в электрофорезе . Вообще говоря, SSCA недостаточно чувствителен для выявления единичной замены, но при достаточном количестве полиморфизмов неметилированных CpG-динуклеотидов в обработанной и необработанной бисульфитом ДНК будет достаточно много, чтобы чувствительности метода оказалось достаточно для определения доли метилированных цитозинов на рассматриваемом участке. Данный метод не позволяет исследовать метилированию в конкретном сайте, однако дает представление о метилировании на уровне некоторого участка или даже всего генома.

Методы высокочувствительного плавления

Метод (HRM) основан на ПЦР в реальном времени . Температуру повышают с 55 до 95 °C, в результате чего комплементарные связи между цепочками разрушаются. Скорость плавления регистрируют при помощи специальных флуоресцентных красителей, и, зная зависимость флуоресценции от нуклеотидной последовательности цепочек, можно различитьоднонуклеотидные полиморфизмы. Метод не дает информации о том, какие именно CpG-динуклеотиды были метилированы и потому не изменились в процессе бисульфитной обработки, однако дает достаточно точную информацию об их количестве на интересующем участке.

Чувствительный к метилированию метод однонуклеотидного удлинения праймера

Метод однонуклеотидного расширения праймера исходно был разработан для анализа однонуклеотидных полиморфизмов . Применительно к анализу метилирования его используют следующим образом. На обработанной бисульфитом одноцепочечной ДНК отжигают праймеры до пары оснований, непосредственно предшествующей интересующему сайту метилирования. Затем праймер удлиняетсяпри помощи ДНК-полимеразы с использованием терминирующих её дидезоксинуклеотидов . Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности определяется по соотношению количеств расширений праймеров нуклеотидами Г и А соответственно. Определить соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности можно разными способами. Используют радиоактивные или , а также пиросеквенирование .

Кроме того, это можно делать при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с последующим применением время-пролетного масс-анализатора (MALDI-TOF) или ион-парной обращённо-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (IP-RP-HPLC) .

Расщепление, специфичное к основанию

Метод основан на использовании специфического расщепления РНК . При добавлении к праймеру в ПЦР промотора РНК-полимеразы in vitro синтезируется РНК-транскрипт интересующего участка, после чего расщепляется рибонуклеазой А . Рибонуклеаза А расщепляет одноцепочечную РНК на местах расположения нуклеотидов Ц и У . Используя устойчивые к расщеплению нуклеозидтрифосфаты dUTP и dCTP, можно добиться специфического расщепления в местах расположения Ц или У. Фрагменты РНК затем анализируют при помощи MALDI - TOF . Данный метод даёт информацию о метилировании каждого из имеющихся CpG-динуклеотидов, а не только о доле метилированных нуклеотидов.

Метилированно-специфичная ПЦР (MSP)

Этот метод использует праймеры, специфичные или только к преобразованной бисульфитом ДНК, или только к непреобразованной . Соответственно, к первым праймерам прикрепляются только участки, которые были метилированы, а ко вторым — те, которые не были, что лишает необходимости секвенировать участки после амплификации.

Амплифицированную в MSP ДНК можно далее анализировать разными другими методами. Метод MethyLight использует MSP в реальном времени , основанную на флуоресценции] . Mc-MSP использует . Высокочувствительный метод плавления использует и то, и другое, и потому обладает достаточной чувствительностью для определения метилирования низкого уровня .

Методы, основанные на микрочипах

Использование ДНК-микрочипов дает возможность расширить описанные выше методы для анализа метилированности на уровне всего генома . Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа делают специфичными к метилированию и соответствующими интересующим CpG-сайтам. Одни комплементарны измененной бисульфитом последовательности (то есть той, в которой CpG-сайт не был метилирован), другие — неизмененной. Примером такого метода служит .

Ограничения методов

Методы бисульфитного секвенирования имеют ряд ограничений. У млекопитающих широко распространена модификация ДНК 5-гидроксиметилцитозин. При обработке бисульфитом 5-гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат, который при секвенировании опознаётся как Ц. Таким образом, бисульфитное секвенирование не может различить 5-гидроксиметилцитозин и , а потому не может рассматриваться как метод, чувствительный только к метилированию ДНК. В 2012 году был разработан метод бисульфитного секвенирования, позволяющий различить эти две модификации .

Поскольку неполное превращение азотистых оснований в ДНК под действием бисульфита, которое возможно только в одноцепочечной ДНК, даёт неправильные результаты, необходима точная подборка условий эксперимента ( температура , концентрация солей), чтобы поддерживать ДНК в денатурированном состоянии . Поддержанию одноцепочечной конформации ДНК может способствовать её закрепление в агарозном геле .

Ещё одна проблема состоит в деградации ДНК при обработке бисульфитом. Поскольку бисульфит действует только на одноцепочечную ДНК, необходимо проводить реакцию в таких условиях, в которых ДНК оставалась бы одноцепочечной, причем проводить её достаточное для успешной конвертации время. Однако, такие условия, а именно высокая температура и длительный период инкубации, могут привести к деградации до 90 % всей ДНК .

Примечания

  1. Lunerová-Bedrichová J. , Bleys A. , Fojtová M. , Khaitová L. , Depicker A. , Kovarík A. (англ.) // The Plant journal : for cell and molecular biology. — 2008. — Vol. 54, no. 6 . — P. 1049—1062. — doi : . — . [ ]
  2. Ou X. , Zhang Y. , Xu C. , Lin X. , Zang Q. , Zhuang T. , Jiang L. , von Wettstein D. , Liu B. (англ.) // Public Library of Science ONE. — 2012. — Vol. 7, no. 9 . — P. e41143. — doi : . — . [ ]
  3. Hayatsu H. , Wataya Y. , Kai K. , Iida S. (англ.) // Biochemistry. — 1970. — Vol. 9, no. 14 . — P. 2858—2865. — . [ ]
  4. ↑ Fraga M. F. , Esteller M. (англ.) // BioTechniques. — 2002. — Vol. 33, no. 3 . — P. 632—634. — . [ ]
  5. El-Maarri O. (англ.) // Advances in experimental medicine and biology. — 2003. — Vol. 544. — P. 197—204. — . [ ]
  6. Laird P. W. (англ.) // Nature reviews. Cancer. — 2003. — Vol. 3, no. 4 . — P. 253—266. — doi : . — . [ ]
  7. Reinders J. , Paszkowski J. (англ.) // Epigenomics. — 2010. — Vol. 2, no. 2 . — P. 209—220. — doi : . — . [ ]
  8. Wojdacz T. K. , Møller T. H. , Thestrup B. B. , Kristensen L. S. , Hansen L. L. (англ.) // Expert review of molecular diagnostics. — 2010. — Vol. 10, no. 5 . — P. 575—580. — doi : . — . [ ]
  9. Frommer M. , McDonald L. E. , Millar D. S. , Collis C. M. , Watt F. , Grigg G. W. , Molloy P. L. , Paul C. L. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1992. — Vol. 89, no. 5 . — P. 1827—1831. — . [ ]
  10. Colella S. , Shen L. , Baggerly K. A. , Issa J. P. , Krahe R. (англ.) // BioTechniques. — 2003. — Vol. 35, no. 1 . — P. 146—150. — . [ ]
  11. Tost J. , Dunker J. , Gut I. G. (англ.) // BioTechniques. — 2003. — Vol. 35, no. 1 . — P. 152—156. — . [ ]
  12. Wong H. L. , Byun H. M. , Kwan J. M. , Campan M. , Ingles S. A. , Laird P. W. , Yang A. S. (англ.) // BioTechniques. — 2006. — Vol. 41, no. 6 . — P. 734—739. — . [ ]
  13. Bianco T. , Hussey D. , Dobrovic A. (англ.) // Human mutation. — 1999. — Vol. 14, no. 4 . — P. 289—293. — doi : . — . [ ]
  14. Wojdacz T. K. , Dobrovic A. (англ.) // Nucleic acids research. — 2007. — Vol. 35, no. 6 . — P. e41. — doi : . — . [ ]
  15. Gonzalgo M. L. , Jones P. A. (англ.) // Nucleic acids research. — 1997. — Vol. 25, no. 12 . — P. 2529—2531. — . [ ]
  16. Uhlmann K. , Brinckmann A. , Toliat M. R. , Ritter H. , Nürnberg P. (англ.) // Electrophoresis. — 2002. — Vol. 23, no. 24 . — P. 4072—4079. — doi : . — . [ ]
  17. Matin M. M. , Baumer A. , Hornby D. P. (англ.) // Human mutation. — 2002. — Vol. 20, no. 4 . — P. 305—311. — doi : . — . [ ]
  18. Ehrich M. , Nelson M. R. , Stanssens P. , Zabeau M. , Liloglou T. , Xinarianos G. , Cantor C. R. , Field J. K. , van den Boom D. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2005. — Vol. 102, no. 44 . — P. 15785—15790. — doi : . — . [ ]
  19. Herman J. G. , Graff J. R. , Myöhänen S. , Nelkin B. D. , Baylin S. B. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1996. — Vol. 93, no. 18 . — P. 9821—9826. — . [ ]
  20. Eads C. A. , Danenberg K. D. , Kawakami K. , Saltz L. B. , Blake C. , Shibata D. , Danenberg P. V. , Laird P. W. (англ.) // Nucleic acids research. — 2000. — Vol. 28, no. 8 . — P. 32. — . [ ]
  21. Akey D. T. , Akey J. M. , Zhang K. , Jin L. (англ.) // Genomics. — 2002. — Vol. 80, no. 4 . — P. 376—384. — . [ ]
  22. Kristensen L. S. , Mikeska T. , Krypuy M. , Dobrovic A. (англ.) // Nucleic acids research. — 2008. — Vol. 36, no. 7 . — P. e42. — doi : . — . [ ]
  23. Adorján P. , Distler J. , Lipscher E. , Model F. , Müller J. , Pelet C. , Braun A. , Florl A. R. , Gütig D. , Grabs G. , Howe A. , Kursar M. , Lesche R. , Leu E. , Lewin A. , Maier S. , Müller V. , Otto T. , Scholz C. , Schulz W. A. , Seifert H. H. , Schwope I. , Ziebarth H. , Berlin K. , Piepenbrock C. , Olek A. (англ.) // Nucleic acids research. — 2002. — Vol. 30, no. 5 . — P. e21. — . [ ]
  24. Yu M. , Hon G. C. , Szulwach K. E. , Song C. X. , Jin P. , Ren B. , He C. (англ.) // Nature protocols. — 2012. — Vol. 7, no. 12 . — P. 2159—2170. — doi : . — . [ ]
  25. Olek A. , Oswald J. , Walter J. (англ.) // Nucleic acids research. — 1996. — Vol. 24, no. 24 . — P. 5064—5066. — . [ ]
  26. Grunau C. , Clark S. J. , Rosenthal A. (англ.) // Nucleic acids research. — 2001. — Vol. 29, no. 13 . — P. 65. — . [ ]
Источник —

elizabeth
  • 2021-11-11
  • 2
  • Tags:

Same as Бисульфитное секвенирование

The title for the last searches