ATAC-seq (от англ. A ssay for T ransposase- A ccessible C hromatin using seq uencing ) — метод для полно геномного оценивания степени открытости хроматина . Метод появился в 2013 году как альтернатива MNase-seq ( секвенирование сайтов, доступных для микрококковой нуклеазы ), FAIRE-Seq и DNase-seq . По сравнению с DNase-seq и MNase-seq ATAC-seq является более быстрым и чувствительным методом анализа ^* .

Описание

ATAC-seq выявляет открытые участки ДНК в составе хроматина с помощью гиперактивной мутантной формы транспозазы Tn5, которая вставляет для секвенирования в открытые участки генома . В то время как транспозазы дикого типа , как правило, обладают невысокой активностью, фермент , использующийся в ATAC-seq, обладает повышенной активностью . В ходе процесса тагментации ( англ. tagmentation ) транспозаза Tn5 вносит двуцепочечные разрывы в открытые участки генома и вставляет в области разрывов адаптеры для секвенирования . Затем фрагменты ДНК, содержащие адаптеры, очищают, амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции и секвенируются с помощью методов секвенирования нового поколения . На основании , полученных в результате секвенирования, можно выявить открытые участки хроматина, участки связывания транскрипционных факторов , а также позиции нуклеосом . Чем более открыт хроматин, тем больше прочтений приходится на соответствующий участок генома, причём точность такой оценки достигает значения в один нуклеотид . В отличие от FAIRE-seq, ATAC-seq не требует обработки ультразвуком или экстракции с помощью фенола и хлороформа ; в отличие от ChIP-seq, этот метод не требует применения антител , а также разрезания ДНК специальными ферментами, как в случае методов DNase-seq и MNase-seq . Пробоподготовка для ATAC-seq занимает всего лишь около трёх часов .

Применение

ATAC-seq используют для количественной оценки участков открытого хроматина. Чаще всего этот метод используют в экспериментах по установлению положения нуклеосом , однако с его помощью можно выявлять сайты связывания транскрипционных факторов и сайты метилирования ДНК . С помощью ATAC-seq можно устанавливать местоположение энхансеров , например, в исследованиях эволюции энхансеров или для выявления специфических энхансеров, функционирующих в ходе дифференцировки клеток крови .

ATAC-seq использовали для полногеномного определения участков активного хроматина в клетках разных видов рака человека . С помощью этого метода было показано общее снижение количества открытых участков хроматина при макулодистрофии . ATAC-seq может быть использован для выявления сайтов связывания белков , специфичных для данных клеток , а также транскрипционных факторов со специфической активностью в разных типах клеток .

ATAC-seq одиночных клеток

Существуют модификации протокола ATAC-seq, предназначенные для анализа хроматина в одиночных клетках. С помощью микрогидродинамических подходов можно выделить отдельные клеточные ядра , и уже на них произвести ATAC-seq . В этом подходе изоляция одиночных клеток происходит до этапа внесения адаптеров для секвенирования в геном . Другой подход, известный как комбинаторная индексация клеток, не требует изоляции одиночных клеток. В этом методе для оценки доступности хроматина в тысячах клеток применяется баркодирование . За один такой эксперимент можно получить эпигеномный профиль для 10000 — 100000 клеток . Однако для комбинаторной индексации клеток требуется дополнительное сложное оборудование и особая форма транспозазы Tn5 .

Биоинформатический анализ данных ATAC-seq одиночных клеток основан на построении матрицы , в которой участкам хроматина противопоставляется число пришедшихся на них прочтений. Такие матрицы могут быть очень велики и содержать сотни тысяч участков хроматина, причём ненулевое количество прочтений приходится не более чем на 3 % из них . Подобно стандартному ATAC-seq, ATAC-seq одиночных клеток позволяет выявлять транскрипционные факторы, активные в данной клетке, например, с помощью анализа количества прочтений, пришедшихся на их сайты связывания .

Примечания