Interested Article - ПЦР с обратной транскрипцией

В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией ( англ. reverse transcription polymerase chain reaction ) принято обозначать как ОТ-ПЦР ( англ. RT-PCR ). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты ( РНК ).

Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, англ. RT, reverse transcription ) в комплементарную ДНК ( cDNA ) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК , используя традиционную ПЦР . RT-PCR не следует путать с ПЦР в реальном времени ( англ. Real-time PCR, Q-PCR ), которую также иногда неверно сокращают как RT-PCR.

Описание метода

Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу :

1. Реакция первой цепочки:

Комплементарная ДНК ( cDNA ) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК- праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C.
2. Реакция второй цепочки:

После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР .

После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.

Применение

ОТ-ПЦР используется для обнаружения молекул РНК в образце с заранее известным участком последовательности, комплементарным праймеру. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК.

Примером являются РНК-вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ ( англ. HIV-Reverse Transcriptase ) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.

Также ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов .

См. также

Примечания

. Дата обращения: 20 октября 2009. 4 октября 2009 года.
↑ Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289 .
Bustin S. A. Journal of Molecular Endocrinology, 25 // Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays (англ.) . — 2000. — P. 169—193.