Двугибридный анализ — молекулярно-биологический метод, позволяющий с высокой точностью детектировать белок-белковые и ДНК-белковые взаимодействия в условиях in vivo .

В его основе лежит использование факторов транскрипции , состоящих из физически и функционально разделимых доменов : ДНК-связывающего ( binding domain, BD ) и активаторного домена ( activation domain, AD ). Физическое взаимодействие двух рекомбинантных белков инициирует слияние «сшитых» с ними транскрипционных доменов, активируя экспрессию репортерных генов .

История

Впервые метод двугибридного анализа был описан и применён С. Филдсом и О. Сонгом в 1989 году при изучении фактора транскрипции GAL4 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Однако с того момента принцип обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием активатора транскрипции GAL4 был адаптирован для создания других альтернативных методов, включая некоторые, способные к обнаружению ДНК-белковых и ДНК-ДНК взаимодействий, а также мульти-белковых комплексов.

Кроме того, помимо дрожжей также используются Escherichia coli и клетки млекопитающих .

Принцип метода

Метод двугибридного анализа основан на особенностях строения промоторов генов GAL , кодирующих белок галактозидазу . Промоторы этих генов состоят из ТАТА-бокса , активаторной последовательности UAS и инициаторного мотива Inr. Появление в клетке галактозы приводит к конформационным изменениям в регуляторных белках , что позволяет белку Gal4p начать действовать в качестве активатора на различных промоторах GAL .

Активатор транскрипции GAL4p — эндогенно экспрессируемый белок длиной в 881 а.о., содержащий 2 домена : ДНК-связывающий (1-147 а.о.) и активаторный (771—881 а.о.). В природных факторах транскрипции эти домены являются частями одной белковой глобулы, однако они также могут быть синтезированы по отдельности, при этом сохраняя свои исходные функции.

В качестве примера опишем устройство классического метода двугибридной системы, используемого для детекции взаимодействий между белками. Для проверки наличия взаимодействия между белком А и белком Б создают рекомбинантные молекулы , одна из которых представляет собой белок А, слитый с ДНК-связывающим доменом (А-СД), а другая — белок Б, слитый с активаторным доменом (Б-АД). В составе химерных белков домены сохраняют свои функции. По отдельности каждая рекомбинантная молекула не способна вызвать активацию транскрипцию , однако находясь в непосредственной близости, возможно обусловленной взаимодействием между белками А и Б, воссоздаётся исходная функция белка GAL4p, и происходит активация репортёрного гена .

При дрожжевом двугибрином скрининге часто используются генетически модифицированные штаммы дрожжей , в которых биосинтез некоторых питательных веществ (как правило, аминокислот или нуклеиновых кислот ) отсутствует. Такие штаммы называются ауксотрофными . При выращивании на средах , где отсутствуют данные питательные вещества, дрожжи погибают. Далее два ауксотрофных штамма трансфецируются плазмидами , в которых галактозидазный промотором регулируется транскрипция гена, кодирующего отсутствующий элемент метаболического пути . Одна плазмида также будет содержать ген белка А, слитого с СД. При этом белок А, как правило, известный. Вторая плазмида будет содержать ген белка Б, слитого с АД. Белок Б при этом может быть либо белком с неизвестной функцией, возможность связывания которого с белком А требуется проверить, либо вместо одной плазмиды с геном фьюжн-белка Б-АД может быть целая библиотека различных плазмид, содержащих гены различных белков, слитых с АД. Таким образом осуществляется скриннинг библиотеки белков на возможность взаимодействия с белком А. Методы с использованием библиотеки предполагают попадание всего одной пары плазмид в исследуемую клетку, тем самым каждая клетка вырабатывает не более одного белка из библиотеки. Далее два ауксотрофных штамма скрещиваются . В полученном гибриде при успешном взаимодействии А и Б, АД и СД домены становятся опосредованно связаны, и АД оказывается в непосредственной близости от сайта начала транскрипции репортёрного гена. Полученный штамм не будет ауксотрофным. При отсутствии взаимодействия нет и транскрипции, гибрид ауксотрофен. Следовательно, успешное взаимодействие связано с изменением клеточного фенотипа .

Двугибридный анализ не требует специального дорогостоящего оборудования и позволяет проводить анализ целых библиотек. Тем не менее, существенным недостатком данного метода является большое количество ложно-положительных результатов .

Вариации двугибридной системы

Тригибридная система

Данный метод основан на тех же принципах, что и двугибридная система, с той разницей, что белки А и Б не взаимодействуют друг с другом непосредственно. Между ними есть третий элемент — вещество Х. Этим веществом может служить молекула ДНК или РНК , малый органический лиганд , ингибитор , ковалентно связывающийся с активным центром фермента . Метод позволяет выявить НК -белковые взаимодействия, ферментативную активность по отношению к данному субстрату , взаимодействие белка с малыми молекулами .

Обратная двугибридная система

Основное отличие от «прямой» двугибридной системы здесь состоит в том, что ген, экспрессия которого регулируется данной системой, является летальным. Таким образом, в случае, если взаимодействие между белками А и Б есть, гибридный организм погибнет. Данный метод используется для определения аминокислотных остатков , необходимых для осуществления взаимодействия между глобулами А и Б .

Одногибридная система

В данной модификации классического метода присутствует только одна рекомбинантная молекула — АД-А-Б-СД. При этом известная последовательность ДНК вставляется перед репортёрным геном , варьируется BD. Так можно определить, какие белки связываются с данной последовательностью ДНК .

Клеточные линии, пригодные для двугибридного анализа

Допускается, что любая живая клетка может быть использована для реализации двугибридой системы, однако имеются практические соображения о дешевизне и устойчивости выбранной клеточной линии .

Дрожжи

Исторически первым для двугибридной системы организмом являются дрожжи . Дрожжи стабильный, простой и хорошо изученный модельный организм . Дрожжевые клетки поддерживают нейтральные значения pH внутри клетки, несмотря на кислые pH во внешней среде. Также дрожжи слабочувствительны к внеклеточным токсинам, ими можно манипулировать, не используя молекулярных методов Важно отметить необходимость сигналов ядерной локализации , так как весь генетический аппарат дрожжей локализован в ядре. При их отсутствии потенциально взаимодействующая пара белков не будет транслирована и не провзаимодействует.

Escherichia coli

Бактериальные системы могут быть использованы аналогично дрожжевым. Они имеют заведомо больший потенциал и являются более предпочтительными для использования двугибридной системы. Бактериальные системы позволяют использовать и анализировать библиотеки размером больше 10 ⁸ , имеют более быстрый темп роста и больший потенциал для проницаемости небольших молекул. Так же отсутствует необходимость в сигналах ядерной локализации , и появляется возможность изучать белки, токсичные для дрожжей. Ввиду более быстрых селективных методов обеспечивается низкий уровень ложных результатов (3·10 ⁻⁸ ) .

Практическое применение

Определение функции белка

При исследовании взаимодействия белков возможно выявление новых функций. С помощью одного известного белка А ₀ , библиотеки неизвестных белков В _n , и последующего сравнения с предварительно известной парой взаимодействующих белков A ₀ B ₀ можно получить информацию о схожести B _n и B ₀ . Похожие данные можно получить путём исследования взаимодействий известной библиотеки белков с одним белком с неизвестной функцией .

Выявление определяющих взаимодействие аминокислотных остатков

Двугибридная система применяется в случае, когда для пары известных и взаимодействующих белков необходимо определить аминокислотные остатки , формирующие область их взаимодействия. Для этого в используемых плазмидах осуществляются мутации соответствующих специфическим аминокислотам пар оснований ДНК. Таким образом, формируется библиотека с точечными изменениями аминокислотных остатков, на основе которой с помощью двугибридной системы можно определить важность той или иной аминокислоты в формировании взаимодействия с белком-партнёром .

Применение в медицине

Современные методы позволяют сконструировать выбранную для исследования клетку таким образом, чтобы она отображала тот или иной молекулярный аспект, выбранный для изучения. В таких клетках становятся возможны опосредованные двугибридной системой испытания специфичности и точности доставки лекарственных препаратов, позволяющие оперативно решать проблемы возникающих побочных эффектов.

Аналогичный подход используется для токсинов и ядов .

Поиск белков цинкового пальца

Для поиска белков цинкового пальца (zinc finger proteins или ZFPs) успешно применяются методы, созданные на основе двугибридного анализа . Являясь ДНК-связывающим белком, ZFP используется для создания нестандартных ДНК-связывающих доменов, которые координируются с заранее определённым участком ДНК-последовательности.

В основе метода лежит создание библиотеки ZFP за счёт случайного изменения определённых аминокислотных остатков. Далее из них отбираются те, что способны взаимодействовать с сайтом-мишенью, включённым в UAS, соответствуя требуемым характеристикам. Однако каждый ZFP распознаёт только небольшой участок ДНК, около 3-4 оснований, поэтому, для повышения точности связывания и предотвращения распознавания сайтов за пределами UAS, используется комплекс, состоящий из двух ZFP с постоянной последовательностью. ZFP из подобного комплекса связываются по краям необходимой области и предотвращают связывание вне UAS .

Ряд других ДНК-связывающих доменов также может быть исследован с использованием этой системы.

Примечания