Interested Article - Пероксидаза хрена

Пероксидаза хрена ( англ. Horseradish peroxidase, HRP ) — фермент , выделенный из хрена , широко применяющийся в молекулярно-биологических методиках для усиления слабого сигнала до уровня, необходимого для детекции. Пероксидаза хрена имеет молекулярную массу около 44173.9 Да, представляет собой гликопротеид и имеет четыре остатка аминокислоты лизина для соединения с молекулой, которую требуется пометить.

Продукт активности пероксидазы хрена представляет собой цветное или люминесцентное соединение, подходящее для детекции и количественного анализа. HRP часто используют в составе для детекции определенных молекул. Например, в случае вестерн-блоттинга используют конъюгаты HRP с антителами против заданных белков или молекул; в данном случае антитело обладает специфичностью к заданной мишени, а HRP образует детектируемый сигнал. . Пероксидазу хрена также используют в таких методиках, как ИФА и для иммуногистохимического анализа.

Пероксидаза хрена представляет собой идеальный фермент для многих методик, так как имеет относительно небольшой размер, относительно стабильна и более дешева, чем альтернативы — например, щелочная фосфатаза . HRP имеет б о льшее количество оборотов в единицу времени и потому обеспечивает развитие достаточно сильного сигнала за относительно небольшой период времени.

Применение

В последние годы методика мечения нейронов пероксидазой хрена стала одним из основных инструментов исследований. За короткий промежуток времени пероксидазу хрена стали применять больше нейробиологов, чем метод окраски по Гольджи с 1870 года. D. Purves and J.W. Lichtman, Principles of Neural Development.

Пероксидаза хрена в свободной форме или в виде с другими молекулами требует наличие субстрата для визуализации. HRP окисляет субстрат в присутствии пероксида водорода , при этом образуются продукты, которые можно детектировать спектрофотометрически .

Коммерчески доступные субстраты пероксидазы хрена 3,3’,5,5’- ( англ. TMB ) и 3,3'- Диаминобензидин ( англ. DAB ) при окислении дают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL являются источниками детектируемого света при действии HRP.

Усиление хемилюминесценции (ECL)

Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3- через серию интермедиатов . Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм. В присутствии некоторых веществ возможно достичь усиления свечения до тысячи раз. Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции ( англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Наиболее эффективными усилителями являются производные фенолов, например, п-йодфенол. ECL позволяет детектировать около 0,5 пикограмма нуклеиновой кислоты при Саузерн-блоттинге .

Примечания

PDB ; Carlsson G.H., Nicholls P., Svistunenko D., Berglund G.I., Hajdu J. Complexes of horseradish peroxidase with formate, acetate, and carbon monoxide (англ.) // Biochemistry : journal. — 2005. — January ( vol. 44 , no. 2 ). — P. 635—642 . — doi : . — .
Chau Y.P., Lu K.S. Investigation of the blood-ganglion barrier properties in rat sympathetic ganglia by using lanthanum ion and horseradish peroxidase as tracers (англ.) // ACTA ANATOMICA (BASEL) : journal. — 1995. — Vol. 153 , no. 2 . — P. 135—144 . — .
In recent years the technique of marking neurons with the enzyme horseradish peroxidase has become a major tool. In its brief history, this method has probably been used by more than have used the since its discovery in 1870
Quoted in от 24 апреля 2005 на Wayback Machine adapted from D. Purves and J.W. Lichtman, Principles of Neural Development. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, 1985.
N.C.Veitch. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2004. — Vol. 65 , no. 3 . — P. 249—259 . — doi : .