Усто́йчивость (резисте́нтность) к противогрибко́вым препара́там — отсутствие фунгистатического или фунгицидного действия антимикотика на грибок. Устойчивость к действию противогрибковых лекарственных препаратов первой линии обнаружена у всех основных возбудителей глубоких и поверхностных микозов человека, включая Candida spp. , Aspergillus spp. , Cryptococcus spp. , Trichophyton spp. , но её распространенность варьирует в разных странах. Устойчивость входит в число факторов, влияющих на эффективность противогрибковой терапии, наряду с наличием фоновых заболеваний, комплаентностью пациента, индивидуальными особенностями иммунной системы пациента и качеством лекарственного препарата .

Терминология

Если геном гриба содержит мутации, обусловливающие снижение эффективности антимикотика, говорят о его микробиологической устойчивости . Под эпидемиологическим пороговым значением ( англ. epidemiological cut-off value, ECOFF ) понимается такая концентрация антимикотика, которая позволяет отделить штаммы дикого типа от мутантных штаммов. Клиническая устойчивость — это способность грибка выживать и размножаться под действием терапевтических доз антимикотиков, что in vivo выражается в неэффективности противогрибковой терапии .

Дифференциация штаммов и видов грибков на чувствительные и устойчивые при оценке как микробиологической, так и клинической устойчивости к антимикотикам производится с помощью оценки минимальных пороговых концентраций. Минимальная пороговая концентрация (МПК) — это минимальная концентрация антимикотика, которая приводит к ингибированию роста грибка в эксперименте in vitro . Ингибирование роста грибков при достижении МПК антимикотика (фунгистатический эффект) не говорит о наличии у антимикотика в искомой концентрации фунгицидного эффекта. Для оценки последнего необходимо определение минимальной фунгицидной концентрации , которая зачастую превышает МПК. Наличие клинической устойчивости у изолята оценивают сравнивая МПК антимикотика с клиническими пороговыми значениями ( англ. clinical breakpoint, CBP ). Клинические пороговые значения устанавливаются путем соотнесения МПК лекарственного средства для определённого инфекционного агента с его фармакокинетикой и реальным клиническим опытом .

Понятия клинической и микробиологической устойчивости грибков к антимикотикам не являются синонимичными: так, некоторые мутантные штаммы, несущие в себе генетические детерминанты резистентности, могут фенотипически не проявлять достаточного повышения уровня устойчивости, выраженного в МПК, что будет характеризовать штамм как клинически чувствительный. Также, в экспериментальной науке под устойчивостью иногда понимают способность изолята грибка к росту в присутствии такой концентрации противогрибкового лекарственного средства, которая ингибирует рост других изолятов того же вида .

Определение чувствительности к антимикотикам

Для ручного определения чувствительности используют три основных метода: диск-диффузионный метод, метод серийных разведений и Etest. Также существуют автоматизированные системы, позволяющие определять чувствительность дрожжей, например, Vitek 2 (биоМерье), или дрожжей и плесневых грибов, например, Sensititre (БиоВитрум). Разработкой стандартов тестирования на чувствительность к антимикотикам занимаются в и . Поскольку активность антимикотиков в отношении различных микромицетов варьирует, во многих случаях можно надежно предсказать устойчивость возбудителя, выяснив его видовую принадлежность.

Природная устойчивость

Генетические линии грибов, независимо от их таксономического статуса, — родового, видового или внутривидового, могут характеризоваться различными уровнями чувствительности к антимикотикам. Например, Clavispora lusitaniae дикого типа чувствительна к повышенным дозировкам флуконазола, а Candida ( Clavispora ) auris , как правило, — нет . Природную устойчивость последней удается объяснить наличием определённых аминокислот в консервативных участках Erg11 , которые у изолятов Candida albicans появляются только вследствие адаптации к лекарству . Внесение в геном чувствительного к флуконазолу и вориканазолу Aspergillus fumigatus последовательности CYP51A мукорового гриба Rhizopus arrhizus приводит к развитию у аспергилла устойчивости, свойственной ризопусу . Поэтому природную устойчивость Rhizopus arrhizus к этим азолам можно связать с особенностями структуры Cyp51A. Для одной из клональных линий C. albicans , выявляемой методом мультилокусного секвенирования-типирования , показана ассоциация с устойчивостью к фторцитозину и тербинафину . Для комплекса видов Trichophyton mentagrophytes / Т. interdigitale известно около 15 генотипов региона ITS, но в подавляющем большинстве случаев устойчивость наблюдается у изолятов Тип VIII .

Механизмы возникновения устойчивости

Развитие устойчивости к антимикотикам происходит вследствие накопления мутаций в геноме микромицета под селективным давлением противогрибкового препарата. Спектры таких мутаций различны для каждого класса антимикотиков. Изоляты чувствительного генотипа могут приобретать устойчивый фенотип при вхождении в состав биопленки .

Устойчивость к азолам

Механизмы возникновения устойчивости к азолам лучше всего изучены у Candida albicans , но весьма вероятно, что первые два из перечисленных далее являются общими для всех грибов, значимых для медицины .

Активный экспорт: азолы могут быть удалены из клетки за счет повышения экспрессии мембранных переносчиков, что препятствует достижению концентрации лекарственного средства, достаточной для успешного ингибирования Erg11. В этом процессе участвуют два семейства переносчиков: облегчающие транспорт факторы MFS (например, MDR1 ), и ABC-транспортеры (например, CDR1 и CDR2 ). Повышение экспрессии генов, кодирующих мембранные переносчики, происходит вследствие мутаций в генах транскрипционных факторов. Интересно, что эксперименты с изолятами дикого типа, принадлежащими к комплексу видов C. haemulonii , не выявили повышения экспрессии генов мембранных насосов в присутствии флуконазола или вориконазола .

Модификация мишени: ген ERG11 может мутировать таким образом, что кодируемая им ланостерол 14α-деметилаза теряет сродство к азолам. По состоянию на 2010 год, для не менее чем 9 аминокислотных замен в белке Erg11 был экспериментально доказан вклад в развитие устойчивости к азолам, при помощи а) наблюдения повышенной МПК после экспрессии гетерологичного гена в дрожжах Saccharomyces cerevisiae посредством сайт-направленного мутагенеза, б) функциональной экспрессии ERG11 , амплифицированного из C. albicans , в) выявления сниженного сродства ланостерол 14α-деметилазы к азолу . У грибов рода Aspergillus , ген ланостерол 14α-деметилазы обозначают как CYP51 . Aspergillus fumigatus обладает двумя его паралогами , CYP51A и CYP51B , развитие устойчивости происходит вследствие накопления мутаций в CYP51A и увеличения количества нуклеотидных повторов в его промоторе . В геноме A. flavus присутствуют три паралога CYP51 , мутации, потенциально обусловливающие устойчивость, обнаруживаются в CYP51A и CYP51C .

Повышение экспрессии гена мишени азолов, ланостерол 14α-деметилазы, может привести к тому, что достижение ингибирующей рост штамма концентрации антимикотика станет невозможным, и синтез эргостерола будет продолжаться. Происходит вследствие мутаций в гене соответствующего транскрипционного фактора, увеличивающих сродство самой регуляторной молекулы к энхансеру гена ERG11 .

Отсутствие токсичного промежуточного продукта: при ингибировании Erg11 в клетке происходит накопление метилированного промежуточного соединения, 14α-метилфекостерола. Это соединение используется в качестве субстрата Δ5-6-десатуразой Erg3, с образованием токсичного продукта. Обнаружены штаммы с гомозиготными мутациями гена ERG3 , обусловливающими потерю функциональности белком Erg3. Следовательно, эти штаммы не превращают метилированные соединения в токсичные соединения, что объясняет их устойчивость к азолам . Это отсутствие функционального Erg3 обычно сочетается с устойчивостью к амфотерицину B, поскольку отсутствие Δ5-6-десатуразы перекрывает путь биосинтеза эргостерола.

Потеря гетерозиготности. У диплоидных дрожжей рода Candida мутации, обусловливающие возникновение устойчивости, могут появляться в одной хромосоме из двух гомологичных. При потере гетерозиготности, аллель с детерминантой устойчивости оказывается в гомозиготном состоянии, и его эффект усиливается .

Анеуплоидии. Устойчивые к азолам изоляты дрожжей часто имеют аберрантный кариотип . В исследовании 2015 года у клинических изолятов C. albicans , полученных от больных с кандидозом полости рта, хромосомные перестройки были нестабильными. Достоверная корреляция с уровнем устойчивости к азолам отсутствовала . Однако в более поздней работе 2021 года у одного из изученных штаммов C. auris дупликация сегмента хромосомы 1, содержащей ERG11 , была единственной мутацией, которой можно было бы объяснить повышенную МПК флуконазола. У другого штамма дупликация всей хромосомы 5, содержащей ген транскрипционного фактора TAC1b , была единственным возможным объяснением 32-кратного повышения МПК флуконазола . В экспериментах по культивированию Cryptococcus neoformans в присутствии флуконазола была показана корреляция числа дисомий нескольких различных хромосом с МПК лекарства. После переноса штаммов в среду, не содержащую флуконазола, дополнительные копии хромосом терялись и первоначальная чувствительность к флуконазолу восстанавливалась .

Образование биопленок. Нахождение в составе биопленок сопровождается рядом обратимых эффектов.

• Активный экспорт. В экспериментах in vitro , на ранних этапах развития биопленок происходит физиологическое повышение экспрессии генов мембранных насосов .
• Чувство кворума . Фарнезол , соединение, блокирующее образование псевдогиф C. albicans и способствующее переходу этих дрожжей в планктонную форму, снижает экспорт азолов из грибной клетки .
• Связывание азолов. В экспериментах с использованием радиоактивной метки было показано, что внеклеточный матрикс биопленок связывает азолы. Компонентом матрикса, ответственным за это, является β-1,3 глюкан .
• Покоящиеся клетки ( англ. persister cells ) — часть популяции клеток биопленки, характеризующиеся сниженной чувствительностью к нескольким классам лекарственных средств, остающаяся жизнеспособной после воздействия антимикотиком. Она способна восстановить биопленку с тем же процентом устойчивых клеток (0,01—0,02 %), который наблюдался изначально .

Устойчивость к аллиламинам

В 2020 году микробиологическую устойчивость к тербинафину, как правило, связывают с мутациями в гене эпоксидазы сквалена ERG1 . Несмотря на это, часть устойчивых изолятов имеет последовательность ERG1 дикого типа, поэтому имеют место и другие механизмы возникновения устойчивости к данному антимикотику .

Устойчивость к эхинокандинам

Мишенью эхинокандинов является фермент β-1,3-D-глюкан синтаза, отвечающая за синтез компонента клеточной стенки . Устойчивость к эхинокандинам развивается за счет появления аминокислотных замен в данном ферменте, причем у грибов рода Candida основная часть изменений ограничена двумя участками полипептида, так называемыми «горячими точками» .

Факторы, влияющие на возникновение устойчивости

К причинам возникновения устойчивости относят несистематическое применение противогрибковых лекарственных средств. Отклонение от дозировки и режима приема препарата, оптимизированных для достижения клинического эффекта, дает грибу возможность приспособиться к существованию в присутствии лекарства. Основным механизмом возникновения точечных мутаций являются ошибки ДНК-полимераз, и высокая численность популяции активно делящихся клеток гриба ассоциирована с высокой вероятностью развития устойчивости. Поэтому хронический аспергиллез легких, при котором возможно спороношение, с большей вероятностью будет осложнен лекарственной устойчивостью по сравнению с внелегочными формами . Поскольку инородные тела в человеческом организме являются хорошим субстратом для роста биопленок, в течение первых 24 часов с момента выявления кандидемии рекомендуется удаление или замена внутрисосудистых катетеров .

Противогрибковые средства не увеличивают скорость мутационного процесса, так как отсутствие мутагенного эффекта является обязательным условием выпуска на рынок любого лекарственного препарата. Поэтому (1) мутации в геноме грибка происходят спонтанно; (2) далее происходит избирательное размножение носителей мутаций, благоприятствующих выживанию .

Эпидемиология

Если устойчивость бактерий отчасти определяется генами, располагающимися на плазмидах и иных мобильных генетических элементах , то для грибов это не характерно. Также, горизонтальный перенос генов у грибов редок . Поэтому резистентность грибов распространяется исключительно с устойчивыми штаммами. Вопрос о передаче устойчивых штаммов Candida spp. от человека к человеку при половом контакте является спорным , но возможность заражения новорожденного ребёнка от матери хорошо установлена . То же самое относится и к Trichophyton spp., передающимся половым путем . Поскольку значительная часть противогрибковых препаратов сходна по химическому строению с сельскохозяйственными фунгицидами , источником устойчивых изолятов при поражениях легких, вызванных плесневыми грибами, могут быть сельскохозяйственные угодья .

Сопутствующие явления

Мутационные изменения, направленные на повышение устойчивости грибка к антимикотикам, могут приводить к повышению его вирулентности . Так, мутации в гене транскрипционного фактора PDR1 , отвечающие за повышение экспрессии генов мембранных насосов у Candida glabrata , были ассоциированы со снижением эффективности поглощения дрожжевых клеток макрофагами .

При тестировании изолятов микромицетов на чувствительность in vitro можно наблюдать несколько необычных явлений. Противогрибковая толерантность является характеристикой чувствительных к лекарствам штаммов, которые обладают способностью медленно расти при ингибирующих концентрациях лекарственного средства; обычно только некоторые из клеток данной популяции демонстрируют этот медленный рост . То же самое, что и следовой рост ( англ. trailing growth ) . Гетерорезистентность — клинический термин для изолятов, содержащих небольшие субпопуляции клеток (обычно <1 %), которые обладают способностью расти при концентрациях лекарственного средства, по крайней мере в восемь раз превышающих МПК для подавляющего большинства чувствительных клеток в популяции. Парадоксальный рост — способность грибкового изолята восстанавливать рост в присутствии высоких концентраций лекарственного средства, но быть полностью чувствительным при более низких концентрациях. Парадоксальный рост появляется с задержкой от одного до нескольких дней, но напоминает рост при отсутствии препарата. Сообщалось о парадоксальном росте в первую очередь в присутствии эхинокандинов . По состоянию на 2020 год, клиническая значимость и молекулярные механизмы данных явлений оставались малоизученными .

Детерминанты устойчивости и лабораторная диагностика

Механизмы приобретенной устойчивости к наиболее распространенным антимикотикам многообразны, это препятствует разработке тест-систем для молекулярной диагностики. Однако существуют несколько схем ПЦР для выявления мутаций в генах FKS1 и FKS2 изолятов C. glabrata , обусловливающих устойчивость к эхинокандинам . Кроме того, предложена ПЦР тест-система для выявления мутации в ERG1 , отвечающей за устойчивость T. mentagrophytes к тербинафину . Для Aspergillus fumigatus есть пример того, как открытие новых механизмов устойчивости поставило под вопрос применимость ранее разработанной тест-системы, ориентированной на непосредственное выявление функциональных мутаций .

См. также

• Резистентность (биология)
• Резистентность к антимикробным препаратам
• Адаптивный мутагенез

Примечания