Interested Article - Криоэлектронная томография

Схема электронной томографии. Образец наклоняется под разными углами к электронному лучу, в результате "наклона" получаются серии 2D-изображений. Серии изображений с наклоном преобразовываются на компьютере в 3D "томограммы".

Электронная крио-томография ( ЭКТ , также крио-электронная томография, крио-ET или CET ) — способ получения трехмерного изображения с высоким разрешением (~4 нм). Используется для получения изображений биологических макромолекул и клеток .

ЭКТ используется с применением просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), в которой образцы наклоняются под разными углами к электронному лучу, в результате получаются серии двумерных изображений. Серии двумерных изображений с наклоном обрабатываются на компьютере, в результате получается трёхмерная томограмма.

В отличие от методик, использующих электронную томографию , в данной методике исследуемые образцы замораживают по специальной технологии, так чтобы объект исследования не повредился кристаллами льда, давлением, химическими веществами и прочими факторами. Такая процедура называется криофиксацией. Обычно органический образец охлаждают так, чтобы образовавшийся лёд был аморфным (некристаллическим, т.о. проводят витрификацию) , а просвечивание ведётся в криогенных условиях при температурах ниже $-150$ °С, что препятствует разрушению биологических структур .

Описание техники

Пример электронной крио-томографии. На рисунке показана центральная часть томографической реконструкции клетки *Bdellovibrio bacteriovorus* . Шкала 200 нм.

В электронной микроскопии (ЭМ) образцы находятся в глубоком вакууме. Такой вакуум неприменим для биологических образцов, так как в клетках закипает вода и они взрываются. При комнатной температуре в ЭМ образцы обезвоживают. Другим подходом к стабилизации биологических образцов, является их заморозка ( крио-электронная микроскопия ). В крио-электронной микроскопии, образцы (обычно мелкие клетки (например, бактерии или Археи ) или вирусы ) подготавливают для исследования в обычных водных средах. Образцы погружают в криоген (обычно жидкий этан ), при этом молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. В результате такого охлаждения вода переходит в состояние аморфного льда. При этом сохраняются клеточные структуры, такие как липидные мембраны, которые обычно разрушаются при обычном замораживании. Замороженные образцы хранятся при температуре жидкого азота и вода не прогревается настолько, чтобы кристаллизоваться.

Образцы просматриваются в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ). Они наклоняются под разными углами относительно электронного пучка (обычно каждые 1 или 2 градуса примерно от -60° до +60°), получаются изображения под каждым углом. Серия изображений обрабатывается на компьютере и получается трехмерное изображение интересующего объекта . Полученное изображение называется томограммой или томографической реконструкцией.

Особенности

В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) электроны взаимодействуют с материалом образца, поэтому разрешение ограничено его толщиной. Пробы должны иметь толщину не менее ~500 нм для достижения “макромолекулярного” разрешение (~4 нм). По этой причине большинство ЭСТ исследований были сосредоточены на изучении очищенных макромолекулярных комплексов, вирусов и мелких клеток, таких как многие виды бактерий и Архей .

Сильное взаимодействие электронов с веществом приводит к эффектам анизотропии. При наклоне образца электронный луч взаимодействует с относительно большой площадью поперечного сечения. Это приводит к тому, что на практике, углы наклона большие, чем 60—70° не дают много информации и поэтому не используется.

В ЭКТ также применяются крио- флуоресцентная микроскопия , световая микроскопия (например, крио-Палм ) и др. методики. В этих методиках образец, содержащий флуоресцентно-меченый белок замораживается и просматривается в световом микроскопе. При этом образец должен храниться при температурах (ниже -150°С). Флуоресцентный сигнал идентифицируется и образец передается для изучения в крио-ET.

См. также

Примечания

Gan, Lu; Jensen, Grant J. (неопр.) // Quarterly Reviews of Biophysics. — 2012. — 1 February ( т. 45 , № 1 ). — С. 27—56 . — ISSN . — doi : . — .
↑ . Дата обращения: 8 октября 2017. 8 октября 2017 года.
Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, J. J.; Homo, J. C.; Lepault, J.; McDowall, A. W.; Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens (неопр.) // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1988. — 1 May ( т. 21 , № 2 ). — С. 129—228 . — ISSN . — doi : . — .
Lučič, Vladan; Rigort, Alexander; Baumeister, Wolfgang. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2013. — 5 August ( vol. 202 , no. 3 ). — P. 407—419 . — ISSN . — doi : . — . — PMC .
Zhang, Peijun. Correlative cryo-electron tomography and optical microscopy of cells (англ.) // Current Opinion in Structural Biology : journal. — 2013. — 1 October ( vol. 23 , no. 5 ). — P. 763—770 . — ISSN . — doi : . — .
Chang, Yi-Wei. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography (англ.) // Nature Methods : journal. — 2014. — 1 July ( vol. 11 , no. 7 ). — P. 737—739 . — ISSN . — doi : . — .