Interested Article - Helicos Biosciences

Helicos Biosciences — это компания, которая предоставила революционно новую технологию секвенирования единичных молекул, названную true Single Molecule Sequencing (tSMS) .

tSMS позволяет проводить одновременное прямое секвенирование миллиарда цепей ДНК . Процесс секвенирования включает в себя несколько этапов . На первом шаге подготавливаются образцы за счет разрезания ДНК на фрагменты . Далее к каждому фрагменту присоединяется полиадениновый хвост с помощью аденозин-концевой трансферазы . На следующем этапе денатурированная ДНК с полиаденозиновым хвостом гибридизуется на политиминовых олигонуклеотидах, которые соединены с проточной кюветой . Цикл секвенирования состоит из удлинения за счет одного из четырёх флуоресцентно-меченых нуклеотидов , присоединение которого детектируется на секвенаторе компании Heliscope . Последующее отщепление флуорофора позволяет запустить следующий цикл присоединения флуоресцентно-меченых нуклеотидов , которые позволяют определить последовательность ДНК .

История

Компания Helicos Biosience была основана в 2003 году . За основу tSMS™ технологии была взята работа Браславского (Braslavsky) и его коллег, посвященная секвенированию единичных молекул ДНК у человека и дрожжей . Позже технология была усовершенствована на основе работ Озолака (Ozsolak) и Милоса (Milos), что позволило осуществлять более точный синтез гомополимеров и прямое РНК-секвенирование .

Компания создала Genetic Analysis Platform первый в мире ДНК-микроскоп. Платформа была разработана Браславским (Braslavsky) и его коллегами в 2003 году . Преимущество этой технологии в том, что нет необходимости производить амплификацию образцов ДНК, а также в более высокой скорости секвенирования по сравнению с секвенаторами второго поколения . Heliscope секвенатор способен секвенировать до 28 Гб одновременно и это займет около 8 дней . Он генерирует короткие риды (reads) с максимальной длиной в 55 нуклеотидных оснований .

В ноябре 2012 года компания Helicos Biosience была признана банкротом и прекратила существование .

Этапы секвенирования

Процесс секвенирования включает следующие этапы:

подготовка образцов;
секвенирование и визуализация .

Подготовка образцов

Компания Helicos Biosience предоставляла две технологии подготовки образцов: one-pass sequencing и two-pass sequencing . Отличительной особенностью этих методов является отсутствие стадии амплификации образцов с помощью ПЦР (Полимеразмой Цепной Реакции), при которой есть вероятность ошибки при репликации .

One-pass sequencing

На первом этапе праймеры , распределённые на твёрдой основе, ковалентно с ней связаны . На следующем этапе образцы одноцепочечной ДНК , расщеплённые на фрагменты и к которым уже присоединены адаптеры к праймерам , гибридизуются на иммобилизованных праймерах , после чего с ними связывается ДНК-полимераза и происходит синтез .

Two-pass sequencing

В этом случае, сами одноцепочечные фрагменты ДНК ковалентно сшиваются с твёрдой основой с помощью комплекса стрептовидин- биотин и после этого к одноцепочечным фрагментам ДНК присоединяются праймеры , с которыми может связаться ДНК-полимераза .

Секвенирование и визуализация

Процесс секвенирования включает следующие стадии:

Посадка ДНК-полимеразы на праймеры ;
Присоединение только одного флуоресцентно-меченого нуклеотида , который комплементарен иммобилизованному ДНК фрагменту;
Терминация синтеза, после присоединения одного нуклеотида ;
Смываются оставшиеся не присоединенные нуклеотиды ;
Визуализация присоединенного нуклеотида ;
Стадия расщепления, в которой удаляется ингибирующая группа и флуоресцентный краситель с помощью трис (2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP);
Свободная сульфогидридная группа кэпируется йодоацетамидом;
Перед началом следующего цикла снова омывают твёрдую основу с образцами .

Компания использует одноцветный краситель для проведения циклов . Для визуализации флуоресцентного красителя используется технология TIRT (total internal reflection fluorescence), в которой присутствуют два лазера с длинами волн 635 нм и 532 нм . Аналогичная технология используется и Illumina/Solexa геномным анализатором . В качестве флуоресцентного красителя используется Cy5 краситель .

Применение

Продукция большого количества ридов с низкой стоимостью позволило использовать технологии секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing) в широком круге исследований . В частности технологии компании Helicos Biosience позволяют проводить следующие исследования:

секвенирование фрагментов генома, а также всего генома различных организмов ;
секвенирование ДНК из костей древних животных ;
прямое РНК-секвенирование ;
секвенирование индивидуальных геномов, что вероятно может быть использовано при исследовании различных генетических заболеваний .

Преимущества и недостатки

Главными преимуществами данного метода являются отсутствие стадии амплификации образцов, а также достаточно высокая скорость секвенирования и более низкая стоимость по сравнению с секвенаторами второго поколения . К примеру, секвенирование генома человека обходится в 48000$US . Однако, у этого метода есть ряд недостатков. Например, все же остается достаточно высоким уровень ошибок по сравнению с другими секвенаторами нового поколения .

Примечания

↑ Milos P. (англ.) // Pharmacogenomics. — 2008. — April ( vol. 9 , no. 4 ). — P. 477—480 . — doi : . — . [ ]
↑ Pareek C. S. , Smoczynski R. , Tretyn A. (англ.) // Journal Of Applied Genetics. — 2011. — November ( vol. 52 , no. 4 ). — P. 413—435 . — doi : . — . [ ]
↑ Su Z. , Ning B. , Fang H. , Hong H. , Perkins R. , Tong W. , Shi L. (англ.) // Expert Review Of Molecular Diagnostics. — 2011. — April ( vol. 11 , no. 3 ). — P. 333—343 . — doi : . — . [ ]
Harris T. D. , Buzby P. R. , Babcock H. , Beer E. , Bowers J. , Braslavsky I. , Causey M. , Colonell J. , Dimeo J. , Efcavitch J. W. , Giladi E. , Gill J. , Healy J. , Jarosz M. , Lapen D. , Moulton K. , Quake S. R. , Steinmann K. , Thayer E. , Tyurina A. , Ward R. , Weiss H. , Xie Z. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2008. — 4 April ( vol. 320 , no. 5872 ). — P. 106—109 . — doi : . — . [ ]
Braslavsky I. , Hebert B. , Kartalov E. , Quake S. R. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 2003. — 1 April ( vol. 100 , no. 7 ). — P. 3960—3964 . — doi : . — . [ ]
↑ Ozsolak F. , Kapranov P. , Foissac S. , Kim S. W. , Fishilevich E. , Monaghan A. P. , John B. , Milos P. M. (англ.) // Cell. — 2010. — 10 December ( vol. 143 , no. 6 ). — P. 1018—1029 . — doi : . — . [ ]
↑ Ozsolak F. , Milos P. M. (англ.) // Nature Reviews. Genetics. — 2011. — February ( vol. 12 , no. 2 ). — P. 87—98 . — doi : . — . [ ]
Ozsolak F. , Milos P. M. (англ.) // Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.). — 2011. — Vol. 733 . — P. 51—61 . — doi : . — . [ ]
(неопр.) . Дата обращения: 21 июня 2013. 23 сентября 2015 года.
↑ Metzker M. L. (англ.) // Nature reviews. Genetics. — 2010. — Vol. 11, no. 1 . — P. 31—46. — doi : . — . [ ]
Orlando L. , Ginolhac A. , Raghavan M. , Vilstrup J. , Rasmussen M. , Magnussen K. , Steinmann K. E. , Kapranov P. , Thompson J. F. , Zazula G. , Froese D. , Moltke I. , Shapiro B. , Hofreiter M. , Al-Rasheid K. A. , Gilbert M. T. , Willerslev E. (англ.) // Genome Research. — 2011. — October ( vol. 21 , no. 10 ). — P. 1705—1719 . — doi : . — . [ ]