Interested Article - Фаговый дисплей

Фаговый дисплей ( англ. phage display ) — это лабораторный метод изучения белок -белковых, белок- пептидных и ДНК -белковых взаимодействий, использующий бактериофагов для того, чтобы соотнести белки и генетическую информацию, кодирующую их. Суть метода в том, что ген , который кодирует белок, интересующий исследователя, встраивают в ген фага, отвечающий за синтез белка капсида , в результате чего фаг начинает «отображать» исследуемый белок на своей оболочке. Так получают соответствие между генотипом и фенотипом фага, а затем исследуют взаимодействие данного белка с другими белками, пептидами или последовательностями ДНК. С помощью селекции in vitro , аналогичной естественному отбору, и амплификации таким образом могут быть получены большие белковые библиотеки.

Наиболее часто используемыми бактериофагами для фагового дисплея являются M13, T4, T7, и фаг λ .

За использование метода фагового дисплея в отборе пептидов и антител была присуждена Нобелевская премия по химии 2018 г.

История

Метод фагового дисплея был впервые описан Джорджем Смитом (George P. Smith) в 1985 г. , который продемонстрировал «отображение» пептида на филаментном фаге после внесения изменений в ген III этого фага. В том же году получает патент Джордж Печеник (George Pieczenik), который также описывает получение библиотек фагового дисплея. Впоследствии в развитии этой технологии принимали участие группы в Кембридже, (США), (Германия).

Общий вид процедуры

Последовательность шагов исследования методом фагового дисплея

Далее приведены типичные шаги исследования методом фагового дисплея для определения полипептидов, которые связываются с высокой аффинностью с целевыми белками или последовательностями ДНК:

Целевые белки или последовательности ДНК иммобилизованы (зафиксированы) в ячейках микротитрационного планшета .
Различные генетические последовательности, вставленные в ген синтеза капсида, экспрессируются в бактериофагах, таким образом, на оболочке каждого фага «отображается» свой белок, соответствующий внесенным генетическим изменениям.
Эти бактериофаги помещаются на планшет, и спустя некоторое время, которое требуется для связывания, смываются с него.
Таким образом, на планшете останутся только те фаги, которые хорошо связались с целевыми молекулами, а остальные будут смыты.
Связавшиеся фаги могут быть (отмыты) и использованы для получения новых фагов путём заражения подходящих бактерий-носителей. Новая популяция фагов представляет собой смесь, в которой намного меньше нерелевантных (не связывающихся с целевыми молекулами) фагов, чем в изначальной смеси.
Шаги 3-5 опционально можно повторить несколько раз для получения более богатой специфичными фагами популяции.
После амплификации с помощью бактерий секвенируется ДНК полученных специфичных фагов для определения белков или их фрагментов, взаимодействующих с целевыми молекулами.

Применения

Применения технологии фагового дисплея включают в себя определение взаимодействующих веществ для определённого белка, позволяя впоследствии установить функцию или механизм работы этого белка. Фаговый дисплей широко используется для белковой эволюции in vitro — так называемой белковой инженерии . В этом применении он является полезным инструментом для поиска и обнаружения новых лекарств. Также он используется для поиска новых лигандов ( ингибиторов ферментов , агонистов и антагонистов рецепторов) целевых белков .

С помощью этого метода определяют опухолевые антигены (для целей диагностического и терапевтического таргетирования), а также исследуют ДНК-белковые взаимодействия , используя библиотеки специальных последовательностей ДНК с рандомизированными сегментами.

Получение антител in vitro

Изобретение метода фагового дисплея привело к прорыву в области поиска новых антител . В 1991 г. группа Исследовательского центра Скриппса сообщила о первом «отображении» человеческих антител на фаге. Фаговый дисплей библиотек антител стал мощным методом как для изучения иммунного ответа , так и для быстрой селекции и эволюции человеческих антител для последующего использования в терапевтических целях.

Библиотеки антител, отображающие на фагах миллионы различных антител, часто используются в фармацевтической индустрии для выделения узкоспецифичных терапевтических антител с последующей разработкой лекарств, основанных на них, прежде всего противораковых и противовоспалительных.

Примечания

Kehoe J. W., Kay B. K. Filamentous phage display in the new millennium (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2005. — Vol. 105 , no. 11 . — P. 4056—4072 . — doi : .
Smith G. P., Petrenko V. A. Phage display (англ.) // (англ.) ( : journal. — 1997. — Vol. 97 , no. 2 . — P. 391—410 . — doi : .
George P. Smith Nobel Lecture от 23 декабря 2018 на Wayback Machine
Sir Gregory P. Winter Nobel Lecture от 23 декабря 2018 на Wayback Machine
Кирилл Стасевич. (рус.) // Наука и жизнь . — 2018. — № 12 . — С. 10—15 .
Smith G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface (англ.) // Science : journal. — 1985. — Vol. 228 , no. 4705 . — P. 1315—1317 . — doi : . — .
Lunder M., Bratkovic T., Doljak B., Kreft S., Urleb U., Strukelj B., Plazar N. Comparison of bacterial and phage display peptide libraries in search of target-binding motif (англ.) // Appl. Biochem. Biotechnol. : journal. — 2005. — November ( vol. 127 , no. 2 ). — P. 125—131 . — doi : . — .
Bratkovic T., Lunder M., Popovic T., Kreft S., Turk B., Strukelj B., Urleb U. Affinity selection to papain yields potent peptide inhibitors of cathepsins L, B, H, and K (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2005. — July ( vol. 332 , no. 3 ). — P. 897—903 . — doi : . — .
Lunder M., Bratkovic T., Kreft S., Strukelj B. Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display using different elution strategies (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2005. — July ( vol. 46 , no. 7 ). — P. 1512—1516 . — doi : . — .
Hufton S. E., Moerkerk P. T., Meulemans E. V., de Bruïne A., Arends J. W., Hoogenboom H. R. Phage display of cDNA repertoires: the pVI display system and its applications for the selection of immunogenic ligands (англ.) // J. Immunol. Methods : journal. — 1999. — December ( vol. 231 , no. 1—2 ). — P. 39—51 . — doi : . — .
Gommans W. M., Haisma H. J., Rots M. G. Engineering zinc finger protein transcription factors: the therapeutic relevance of switching endogenous gene expression on or off at command (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2005. — December ( vol. 354 , no. 3 ). — P. 507—519 . — doi : . — .