Метод ДНК-комет — это метод регистрации повреждения ДНК и изучения репарации на уровне одиночных клеток. Метод способен выявлять разрывы нитей ДНК в отдельных клетках. Является быстрым и весьма чувствительным .

История

Первым успешным опытом исследования поврежденности ДНК индивидуальных клеток принято считать работу Rydberg и Johanson (1978 г.) . Впоследствии метод неоднократно модифицировался и усовершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК .

Применимость

Метод ДНК-комет применим в системах in vivo и in vitro . В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности ионизирующего излучения , фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза, клинических исследованиях по пренатальной диагностике, предрасположенности к онкологическим заболеваниям, терапии при раке, катаракте. Данный метод постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу:

• оценке влияния пищевого рациона, факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК;
• по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа;
• исследований по экологии.

Использование метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. При этом для анализа необходимо всего несколько тысяч клеток исследуемого образца .

Постановка метода

Проводится иммобилизация подвергнутых воздействию изучаемого фактора клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли приводит к лизису клеточных мембран и экстракции белков. Молекулы ДНК разделяют электрофорезом, треки ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК , что приводит к релаксации этой биомакромолекулы, формируются фрагменты ДНК, не связанные с клеткой. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что и придает наблюдаемым объектам вид «комет» (отсюда и произошло название « », ставшее общеупотребительным). Количество ДНК, мигрировавшей по направлению к аноду и определяемое микрофотометром, может использоваться в качестве показателя, характеризующего уровень повреждений ДНК в изучаемых клетках. «Кометы» анализируют либо путём визуального наблюдения и дифференциации «комет» по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных средств обработки изображений. Последний метод анализа «комет» особенно необходим для объективной оценки влияния небольшой концентрации повреждающего агента, или для выявления незначительных различий между субпопуляциями клеток .

Стандартизация метода

В настоящее время большинство лабораторий, внедривших данный методологический подход в исследования, разработали многочисленные вариации протокола, в частности продолжительности и условий лизиса клеток, денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК. Подсчитывают 25-500 клеток на одном стекле в двух повторах. Результаты эксперимента являются достоверными при повторении не менее 6 раз. Анализ ДНК-комет может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса. При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируют на пять условных типов с соответствующим числовым значением от 0 до 4.

Расчет индексов

Обозначение	Характеристика	Расчёт
${\displaystyle {\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}}$	Индекс ДНК-comet (index of DNA comet) ${\displaystyle {\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}}$ — Степень поврежденности ДНК Индекс ДНК-комет — рассчитывается как отношение суммы «ДНК—комет» каждого типа, к общей сумме подсчитанных «ДНК-комет».	${\displaystyle {\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}={\frac {(0{\mbox{n}}_{0}+1{\mbox{n}}_{1}+2{\mbox{n}}_{2}+3{\mbox{n}}_{3}+4{\mbox{n}}_{4})}{\Sigma }}}$ , где ${\displaystyle {{\mbox{n}}_{0}-{\mbox{n}}_{4}}}$ — число «ДНК-комет» каждого типа, а ${\displaystyle {\Sigma }}$ — сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Программы для работы с изображением и анализа

• — бесплатная программа для полуавтоматических расчетов показателей ДНК-комет, совместима с Windows 5 и 6.
• — GPL software.
• — listed by Comet Assay Interest Group

См. также

• Метафазный анализ
• Ана-телофазный анализ
  • Allium test

Примечания

Литература

• Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением активности системы репарации, что может привести к возникновению мутаций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было разработано много методов, позволяющих регистрировать повреждения ДНК, а также исследовать процессы репарации. Однако не все они обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, необходимой для мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных факторами окружающей среды. Цель обзора состоит в оценке эффективности метода гельэлектрофореза лизированных единичных клеток (метод ДНК-комет) для детекции повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды. Метод обладает чувствительностью, необходимой для регистрации повреждений и репарации ДНК на уровне отдельной клетки, и может быть применен для оценки интегральной целостности генома.
• У.Б. Сорочинска, В.М. Михайленк. (рус.) // ОНКОЛОГИЯ : Статья. — Киев, 2008. — Т. 10 , вып. 3 . — С. 303—309 . 5 марта 2016 года.
• Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth & Rinkevich, Baruch. Genotoxicity of the Kishon River: the application of an in vitro cellular assay : HTML abstract. — Israel: Mutation Research, 2002. — Т. 1 , вып. 518 . — С. 21–37 . — doi : .
• Collins, A.R.; Dobson, V.L.; Dusinska, M.; Kennedy, G. & Stetina, R. The comet assay: what can it really tell us? // Mutation Research : HTML abstract. — 1997. — Т. 2 , вып. 375 . — С. 183—193 . — doi : .
• Klaude, M.; Eriksson, S.; Nygren, J. & Ahnstrom, G. The comet assay: mechanisms and technical considerations. — Mutation Research, 1996. — Т. 2 , вып. 363 . — С. 89—96 . — doi : .
• McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S. Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah & Downes, C. Stephen. : PDF fulltext. — Mutagenesis, 1993. — Т. 1 , вып. 13 . — С. 1—8 . — doi : .
• Olive, P.L.; Wlodek, D. & Banath, J.P. // Cancer Research : PDF fulltext. — 1991. — Т. 17 , вып. 51 . — С. 4671—4676 .
• Rojas, E.; Lopez, M.C. & Valverde, M. Single cell gel electrophoresis: methodology and applications // Journal of Chromatography B : HTML abstract. — 1999. — Т. 722 (1-2) . — С. 225—254 . — doi : .
• Singh, N.P.; McCoy, M.T.; Tice, R.R. & Schneider, E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Experimental Cell Research. — 1988. — Т. 175 (1) . — С. 184—191 . — doi : .