Полони-секвенирование ( англ. polymerase colony — «полимеразная колония») — технология секвенирования нового поколения (NGS) без электрофоретического разделения, позволяющая прочитывать миллионы коротких иммобилизованных последовательностей ДНК , значительно более дешевая по сравнению с секвенированием по Сэнгеру .

Технология была разработана в лаборатории доктора Джорджа Черча ( ) в Гарварде (Гарвардская медицинская школа). По сравнению с другими методиками секвенирования — полони-секвенирование проводится на платформе с открытым исходным кодом и протоколами. Аппаратная платформа данного метода может быть легко комбинирована с широкодоступной и микрофлюидными системами под управлением компьютера.

Основная идея метода — генерация большого числа уникальных 'полоний' (молекулярных колоний, сгенерированных полимеразой), которые секвенируются в случайном порядке. Полони-секвенирование проводится для библиотеки парных концевых тэгов ( ): каждая молекула ДНК имеет длину 135 п.о. ( пар оснований ), содержит два тэга длиной 17-18 п.о., разделённых и фланкированных общей последовательностью. Текущая длина прочтения для этой методики составляет 26 п.о. для ампликона и 13 п.о. для тэга (на каждом тэге остается непрочитанный зазор 4-5 п.о.).

Протокол

В протоколе полони-секвенирования можно выделить три основные стадии:

• конструкция библиотеки парных концевых тэгов
• амплификация
• секвенирование ДНК

Конструкция библиотеки парных концевых тэгов

Протокол начинается с фрагментирования исследуемой геномной ДНК на короткие последовательности (приблизительно равные по длине). Полученные короткие фрагменты подвергаются концевой репарации и концевой обработке аденином (добавление аденина к 3'-концу фрагментированной ДНК). Концевая репарация переводит любые поврежденные или выступающие концы ДНК в 5’-фосфорилированные тупые концы, тем самым обеспечивая немедленное лигирование по тупым концам. При помощи 6 % TBE ПААГ отбираются фрагменты ДНК длиной ~1000 п.о. На следующем этапе молекулы ДНК переводят в кольцевую форму с Т-концевыми синтетическими олигонуклеотидами длиной 30 п.о. (T30). T30 содержат два сайта для MmeI. Полученная кольцевая ДНК реплицируется по типу . Амплифицированные кольцевые молекулы ДНК обрабатываются MmeI рестриктазой ( эндонуклеаза рестрикции II типа), которая проводит разрезание на расстоянии от своего сайта узнавания. В результате рестрикции образуются T30 фрагменты, фланкированные с двух сторон тэгами длиной 17-18 п.о. каждый (общая длина фрагмента таким образом составляет ~70 п.о.). Полученные молекулы с парными концевым тэгами необходимо репарировать перед лигированием с праймерами (FDV2 и RDV2) к их концам для проведения (еПЦР). Компоненты библиотеки — молекулы ДНК длиной 135 п.о. отбираются по размеру и подвергаются . Заключительная стадия конструкции библиотеки — ПЦР -амплификация с целью увеличения количества материала библиотеки и элиминации посторонних продуктов реакции лигирования. Полученные матрицы ДНК включают последовательность FDV (44 п.о.), проксимальный тэг (17-18 п.о.), T30 (30 п.о.), дистальный тэг (17-18 п.о.) и последовательность RDV (25 п.о.).

Наиболее критический этап конструкции библиотеки концевых тэгов — получение кольцевых молекул геномной ДНК вокруг синтетического линкера. Эта стадия является скорость-лимитирующей для всего этапа.

Амплификация матрицы

Эмульсионная ПЦР

Парамагнитные шарики одинакового размера, покрыты стрептавидином и несут биотинилированные форвардные праймеры. Стрептавидин обладает очень сильной аффинностью к биотину, поэтому праймер очень прочно связан с поверхностью шарика. Водная фаза реакции содержит парамагнитные шарики, смесь компонентов для ПЦР, прямой и обратный праймеры, и библиотеку парных концевых тегов. Водная фаза перемешивается и взбалтывается с масляной фазой для получения эмульсии . В идеальной ситуации каждая капля воды в масляной эмульсии сдержит один шарик и одну молекулу матрицы ДНК, что позволяет в миллилитровом объёме проводить миллионы невзаимодействующих реакций ПЦР-амплификации.

Разбиение эмульсии

После амплификации, эмульсия, полученная на предыдущем этапе, разбивается обработкой изопропанолом и буферным раствором с детергентом (10 мМ Трис pH 7.5, 1мМ ЭДТА pH 8.0, 100 мМ NaCl, 1 % (об/об) Тритон X-100, 1 % (вес/об) SDS) и последующим встряхиванием, центрифугированием и магнитной сепарацией . Полученный раствор представляет собой суспензию с пустыми, клональными и неклональными шариками, которые получились из капель эмульсии без матрицы ДНК, с одной матрицей ДНК или с несколькими матрицами ДНК, соответственно. Обогащение шариками с амплифицированными продуктами проводят на следующей стадии.

Обогащение фракции шариками с ампликонами

Обогащение шариками с амплифицированными продуктами достигается за счёт гибридизации с более крупными, немагнитными шариками из полистирола , обладающих низкой плотностью. Полистироловые шарики несут биотинилированные олигонуклеотиды-ловушки (последовательности ДНК, комплементарные к eПЦР амплифицированным последовательностям). Смесь центрифугируют для отделения образовавшихся комплексов (микрошарики с ампликонами и шариками-ловушками) от микрошариков, не несущих ампликоны. Отделяемые комплексы имеют более низкую плотность и остаются в супернатанте , в то время как микрошарики без ампликонов образуют осадок. Супернатант отделяют и обрабатывают щёлочью ( NaOH ) для разрушения комплексов. Парамагнитные шарики с ампликонами отделяют от немагнитных шариков-ловушек при помощи магнитной сепарации . Такой протокол позволяет провести пятикратное обогащение шариками, несущими амплифицированные последовательности.

Кэпирование шариков

Присоединение кэпирущего олигонуклеотида к 3'-концам форвардных праймеров и RDV-сегменту матричной ДНК. Кэп содержит аминокислотную группу, которая препятствует лигированию флуоресцентного зонда к кэпированной последовательности, в то же время кэп способствует взаимодействию последовательности с поверхностью проточной ячейки.

Микрочип на покровном стекле

Покровные стекла моют и обрабатывают . Такая обработка способствует образованию ковалентных связей с матричной ДНК и устранению загрязнений флуоресцентными зондами. Фракцию микрошариков с ампликонами смешивают с акриламидом и выливают в небольшое углубление на предметном стекле, покрытое тефлоном . Предметное стекло с акриламидным гелем сразу же накрывают покровным стеклом, обработанным . Время полимеризации составляет 45 минут. Затем покровное и предметное стекло переворачивают и предметное стекло удаляют. Покровное стекло, обработанное силаном, ковалентно связывается с гелем, в то время как тефлон на поверхности предметного стекла обеспечивает лучшее отделение от акриламидного геля. Покровное стекло затем крепится к телу проточной ячейки и все несвязавшиеся микрошарики удаляются.

Секвенирование ДНК

Биохимическую основой полони-секвенирования служат . Сначала серии якорных праймеров прокачиваются через ячейку, праймеры гибридизуются с последовательностями синтетических олигонуклеотидов непосредственно на 3' или 5’-концах дистальных или проксимальных тэгах (длиной 17-18 п.о) геномной ДНК. Затем, проводится лигирование якорного праймера с вырожденными нонамерами (олигонуклеотиды длиной 9 н.т), меченными флуоресцентными метками.

	5' Cy5‐NNNNNNNNT

	5' Cy3‐NNNNNNNNA

	5' TexasRed‐NNNNNNNNC

	5' 6FAM‐NNNNNNNNG

Нонамеры, несущие флуорофоры, отжигаются с разным успехом к последовательностям тэгов в соответствии с методикой, напоминающей использование вырожденных праймеров. Однако, вместо презентации полимеразе , нонамеры избирательно лигируются на ДНК соседнего якорного праймера. Фиксация молекулы флуорофора обеспечивает сигнал флуоресценции, который позволяет различать присоединение A, C, G или T в исследуемой позиции геномного ДНК-тэга. После получения четырехцветных изображений комплексы между якорными праймерами нонамерными олигонуклеотидами смываются и начинается новый цикл за счёт замещения якорных праймеров. Вносится новая смесь флуоресцентно меченных нонамеров, для которых позиция, нуждающаяся в определении, сдвигается на 1 шаг по геномному тэгу.

	5' Cy5‐NNNNNNNTN

	5' Cy3‐NNNNNNNAN

	5' TexasRed‐NNNNNNNCN

	5' 6FAM‐NNNNNNNGN

Такая методика позволяет узнать последовательность 7 оснований в направлении от 5' к 3' концу и 6 оснований с 3'-конца. Окончательным результатом служит рид длиной 26 оснований (13 с каждого из концевых тэгов) с пропуском в 4-5 оснований в середине каждого тэга.

Временные затраты на выполнение протокола

Конструкция библиотеки концевых тегов занимает ~1 неделю, если длительные циклы инкубации проводить ночью. Протокол может быть остановлен по необходимости после любой стадии очистки продукта. Титрование концентрации матрицы для эмульсионной ПЦР занимает 2 дня. Эмульсионная ПЦР проводится за 2 дня. Запуск процесса секвенирования занимает 3 часа, каждый последующий цикл — 1.75 ч. Общее время непрерывных циклов секвенирования составляет 49 часов.

Анализ данных и программное обеспечение

В результате полони-секвенирования получаются миллионы чтений длиной 26 оснований за запуск. Эту информацию необходимо нормализовать и конвертировать в последовательности. Обработка осуществляется при помощи от 17 июля 2005 на Wayback Machine (Church Lab). Всё программное обеспечение находится в открытом доступе.

Преимущества и недостатки метода

Полони-секвенирование позволяет получать последовательности ДНК с высокой точностью и высокой производительностью при помощи широкодоступного недорого инструмента. Кроме того, эта технология очень гибкая, что позволяет использовать её для различных целей, в том числе для секвенирования искусственных бактериальных хромосом , ресеквенирования бактериальных геномов а также для серийного анализа экспрессии генов ( SAGE ) и техник ДНК-штрихкода. Важным преимуществом полони-секвенирования является его небольшая стоимость. Технология полони-секвенирования может быть реализована при помощи широко доступного флуоресцентного микроскопа и поточной ячейки под управлением компьютера. Согласно расчетам на 2005 г., цена необходимого набора оборудования составляет приблизительно $130,000. Однако стоимость может быть уменьшена до $ 100,000 в ближайшем будущем. Технология полони-секвенирования реализована в приборе под названием . Стоимость прибора составляет $ 170,000. Согласно расчётам на 2005 г., цена каждой килобазы сырых данных составляет $0.11. Без учёта стоимости конструкции библиотеки парных концевых тэгов, цена чтения 1 килобазы может быть снижена до $0.08.

Несмотря на то, что получается большое число сырых первичных данных (786 гигабит), только один бит из 10,000 содержит полезную информацию. Другое затруднение — неравномерная амплификация снижает эффективность секвенирования и является на настоящий момент наибольшей сложностью для этой технологии.

Область применения

Полони-секвенирование наиболее эффективно при наличии референсного генома. Использовалось для ресеквенирования генома E. coli c точностью >99.9999 % и затратами в 9 раз меньше по сравнению с секвенированием по Сэнгеру. Технология полони-секвенирования применяется в платформе SOLiD (Applied Biosystems). PMAGE («polony multiplex analysis of gene expression» — множественный анализ экспрессии генов при помощи полони-технологии). Полони-секвенирование применяется для гаплотипирования и изучения сплайсинга .

Литература

1. Mitra, R. D., J. Shendure, et al. (2003). «Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies.» Anal Biochem 320(1): 55-65.
2. Shendure, J., G. J. Porreca, et al. (2005). «Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome.» Science 309(5741): 1728-32.
3. Porreca, G.J, Shendure, J., Church GM. (2006). «Polony DNA sequencing.» Curr Protoc Mol Biol: Chapter 7:Unit 7.8.
4. Lin B., Wang J., Cheng Y. (2008). «Recent Patents and Advances in the Next-Generation Sequencing Technologies.» Recent Pat Biomed Eng: (1):60-67.

Ссылки

• от 4 марта 2016 на Wayback Machine