Interested Article - TEV-протеаза

aoibhe
  • 2021-08-11
  • 1

Протеаза TEV (от англ. T obacco E tch V irus — ) — высокоспецифичная цистеиновая протеаза вируса гравировки табака. Относится к суперсемейству PA из химотрипсин-подобных протеаз. Благодаря своей высокой специфичности к последовательности часто используется для контролируемого расщепления гибридных белков in vitro и in vivo .

Происхождение

Весь геном вируса гравировки табака кодирует единственный массивный полипротеин (350 кДа), который расщепляется на функциональные блоки тремя протеазами: Р1-протеазой (1 сайт расщепления), HC-Pro (1 сайт расщепления) и TEV-протеазой (7 сайтов расщепления). Нативная протеаза также содержит внутренний участок саморасщепления. Этот участок медленно расщепляется, чтобы инактивировать фермент (физиологическая причина этого неизвестна).

Структура и функции

Структура TEV-протеазы. Два β-цилиндра, которые присущи надсемейству, выделены красным цветом. ( PDB )

Структура TEV-протеазы была определена с помощью рентгеновской кристаллографии . Фермент состоит из двух β-цилиндров и гибкого C-конца, что показывает структурную гомологию с суперсемейством трипсиновых протеиназ (PA-клан,  семейство С4 по классификации MEROPS). Несмотря на гомологию с сериновыми протеазами (такими как трипсин , эластаза, тромбин и т. д.), в протеазе TEV используется цистеин в качестве каталитического центра (как и во многих других вирусных протеазах).

Ковалентный катализ происходит с помощью триады Asp-His-Cys, разделенной между двумя β-цилиндрамим (Asp находится на β1, а His и Cys на β2). Субстрат удерживается в виде β-листа, образуя антипараллельное взаимодействие с бороздкой между двумя цилиндрами и параллельное взаимодействие с C-концом. Таким образом, фермент образует связывающий туннель вокруг субстрата, а взаимодействия боковой цепи обеспечивают специфичность.

Специфичность

Модель поверхности TEV-протеазы, связанной с нерасщёплённым субстратом (черный), также показана каталитическая триада (красный). Субстрат связывается в активном центре тоннеля (слева). В разрезе (справа) показана комплиментарная субстрату форма связывающего тоннеля. ( PDB )

Естественная последовательность расщепления была сначала определена путем изучения участков разрезания в нативном полипротеиновом субстрате для повторяющейся последовательности. Консенсусной последовательностью нативного сайта расщепления является ENLYFQ\S (где ‘\’ обозначает расщепляемую пептидную связь). Аминокислотные остатки субстрата нумеруются с Р6 по Р1 до сайта расщепления и Р1’ после вырезанного участка. В ранних работах также проводили оценку расщепления массива схожих субстратов, чтобы определить насколько специфично фермент будет расщеплять нативную последовательность.

В исследованиях впоследствии применялось секвенирование расщепляемых субстратов из пула рандомизированных последовательностей для определения предпочтительных паттернов. Хотя ENLYFQ\S — это оптимальная последовательность, протеаза активна в большей или меньшей степени на различных субстратах (т. е. проявляет некоторую вариабельность). Наиболее эффективное расщепление происходит в последовательностях наиболее похожих на консенсус EXLYΦQ\φ, где X - любой аминокислотный остаток, Φ - любой большой или  гидрофобный остаток среднего размера, а φ - любой небольшой гидрофобный или полярный аминоктслотный остаток.

Специфичность обеспечивается большой площадью контакта между ферментом и субстратом. Протеазы, такие как трипсин ,  специфичны для одного аминокислотного остатка до и после расщепляемой связи за счет мелкой связывающей щели только с одним или двумя карманами, которые связывают боковые цепи субстрата. И наоборот, вирусные протеазы, такие как TEV-протеаза, имеют длинный C-концевой хвост, который полностью закрывает субстрат для создания связывающего тоннеля. Этот туннель содержит набор связывающих карманов, так что каждая боковая цепь пептидного субстрата (с Р6 до Р1’) связывается с комплиментарным сайтом (с С6 до С1’).

В частности, пептидная боковая цепь P6-Glu контактирует с сетью из трех водородных связей; P5-Asn указывает на растворитель, не создавая специфичных взаимодействий (по этой причине отсутствует консенсус в последовательности субстрата в данном положении); P4-Leu погружает в гидрофобный карман; P3-Tyr удерживает в гидрофобном кармане с короткой водородной связью в конце; P2-Phe также окружен гидрофобнымими остатками, включая поверхность триады гистидина; P1-Gln образует четыре водородные связи; и P1'-Ser только частично заключен в мелкую гидрофобную канавку.

В качестве биохимического инструмента

Одним из основных направлений использования этого фермента является удаление афинных тагов из препаратов очищенного гибридного белка . Причиной использования TEV-протеазы в качестве биохимического инструмента является его высокая специфичность к последовательности. Это делает его относительно нетоксичным in vivo , поскольку узнаваемая им последовательность почти не встречается в белках.

Хотя рациональное конструирование имело ограниченный успех в изменении специфичности протеазы, направленная эволюция использовалась для смены предпочтительного остатка до либо после сайта расщепления.

TEV-протеаза имеет ограничения в использовании. Она склонна к дезактивации путем саморасщепления, хотя этого можно избежаь путём мутации S219V во внутреннем сайте разрезания . Протеаза экспрессированная в одиночку плохо растворима;  было сделано несколько попыток для улучшения её растворимости путем направленной эволюции и компьютерного моделирования. Кроме того, было показано, что экспрессия может быть улучшена путем слияния с , который повышает растворимость партнера.

Молекулярная масса этого фермента лежит в пределах от 25 до 27 кДа в зависимости от того, какая конструкция используются.

Внешние ссылки

Ссылки

  1. Kapust R.B., Waugh D.S. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2000. — July ( vol. 19 , no. 2 ). — P. 312—318 . — doi : . — .
  2. UniProt: TEV polyprotein: . Дата обращения: 11 июля 2017. 27 декабря 2016 года.
  3. ↑ Phan J., Zdanov A., Evdokimov A.G., Tropea J.E., Peters H.K., Kapust R.B., Li M., Wlodawer A., Waugh D.S. Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease (англ.) // Journal of Biological Chemistry : journal. — 2002. — December ( vol. 277 , no. 52 ). — P. 50564—50572 . — doi : . — .
  4. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2012. — January ( vol. 40 , no. Database issue ). — P. D343—50 . — doi : . — . — PMC .
  5. Bazan J.F., Fletterick R.J. Viral cysteine proteases are homologous to the trypsin-like family of serine proteases: structural and functional implications (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. — 1988. — November ( vol. 85 , no. 21 ). — P. 7872—7876 . — doi : . — Bibcode : . — . — PMC .
  6. Dougherty W.G., Parks T.D., Cary S.M., Bazan J.F., Fletterick R.J. Characterization of the catalytic residues of the tobacco etch virus 49-kDa proteinase (англ.) // Virology : journal. — 1989. — September ( vol. 172 , no. 1 ). — P. 302—310 . — doi : . — .
  7. Tyndall J.D., Nall T., Fairlie D.P. Proteases universally recognize beta strands in their active sites (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2005. — March ( vol. 105 , no. 3 ). — P. 973—999 . — doi : . — .
  8. Carrington J.C., Dougherty W.G. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. — 1988. — May ( vol. 85 , no. 10 ). — P. 3391—3395 . — doi : . — Bibcode : . — . — PMC .
  9. Dougherty W.G., Cary S.M., Parks T.D. Molecular genetic analysis of a plant virus polyprotein cleavage site: a model (англ.) // Virology : journal. — 1989. — August ( vol. 171 , no. 2 ). — P. 356—364 . — doi : . — .
  10. Kapust R.B., Tözsér J., Copeland T.D., Waugh D.S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2002. — June ( vol. 294 , no. 5 ). — P. 949—955 . — doi : . — .
  11. Boulware K.T., Jabaiah A., Daugherty P.S. Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics (англ.) // (англ.) ( : journal. — 2010. — June ( vol. 106 , no. 3 ). — P. 339—346 . — doi : . — .
  12. Kostallas G., Löfdahl PÅ, Samuelson P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay (англ.) // PLoS ONE : journal. — 2011. — Vol. 6 , no. 1 . — P. e16136 . — doi : . — . — PMC .
  13. Parks T.D., Leuther K.K., Howard E.D., Johnston S.A., Dougherty W.G. Release of proteins and peptides from fusion proteins using a recombinant plant virus proteinase (англ.) // (англ.) ( : journal. — 1994. — February ( vol. 216 , no. 2 ). — P. 413—417 . — doi : . — .
  14. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. — 2013. — April ( vol. 110 , no. 18 ). — P. 7229—7234 . — doi : . — .
  15. A tobacco etch virus protease with increased substrate tolerance at the P1' position (англ.) // PLoS ONE : journal. — 2013. — Vol. 8 , no. 6 . — P. e67915 . — doi : . — .
  16. Intracellular detection and evolution of site-specific proteases using a genetic selection system (англ.) // Appl. Biochem. Biotechnol. : journal. — 2012. — March ( vol. 166 , no. 5 ). — P. 1340—1354 . — doi : . — .
  17. Kapust R.B., Tözsér J., Fox J.D., Anderson D.E., Cherry S., Copeland T.D., Waugh D.S. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency (англ.) // Protein Eng. : journal. — 2001. — December ( vol. 14 , no. 12 ). — P. 993—1000 . — doi : . — .
Источник —

aoibhe
  • 2021-08-11
  • 1
  • Tags:

Same as TEV-протеаза

The title for the last searches