Interested Article - Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением

cathleen
  • 2021-02-01
  • 1

Принцип метода SELEX: комбинаторный синтез нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), отбор тех из них, которые наиболее прочно связываются с лигандами, амплификация удачных молекул, внесение в них мутаций, чтобы повысить специфичность и силу связывания с лигандами. Далее следует повторение цикла

Системати́ческая эволю́ция лига́ндов экспоненциа́льным обогаще́нием ( англ. SELEX от Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment ) — метод комбинаторной химии , используемый в молекулярной биологии для получения олигонуклеотидов (коротких одноцепочечных молекул РНК или ДНК ), которые специфически связываются с определённым лигандом (или лигандами). Такие олигонуклеотиды называют аптамерами . Чаще всего этот метод называют SELEX, но встречаются также сокращения SAAB (от англ. selected and amplified binding site — отобранный и амплифицированный сайт связывания ) и CASTing (от англ. cyclic amplification and selection of targets — циклическая амплификация и отбор мишеней) . SELEX был разработан в 1990 году. В 2015 году журнал посвятил этому методу специальный выпуск в связи с 25-летием со времени его изобретения .

Процесс начинается с синтеза очень большой олигонуклеотидов, состоящей из случайных последовательностей фиксированной длины с константными 5'- и 3'-участками , которые служат местами отжига праймеров (то есть комплементарного связывания праймеров с матрицей). Далее олигонуклеотиды, входящие в состав библиотеки, взаимодействуют с интересующим исследователя лигандом (чаще всего белком или небольшим органическим соединением ). Те олигонуклеотиды, которые не смогли связаться с лигандом, удаляются при помощи аффинной хроматографии или магнитных шариков . Олигонуклеотиды, связавшиеся с лигандом, элюируют, амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подвергаются последующим циклам отбора, чтобы отобрать молекулы с наибольшим сродством к лиганду .

Метод SELEX уже был успешно использован для разработки ряда аптамеров для клинических и исследовательских целей . С помощью SELEX также были получены аптамеры с нуклеотидами, включающими химически модифицированные сахара или азотистые основания . Модифицированные нуклеотиды могут давать аптамерам дополнительные возможности связывания, а также повышать их стабильность .

Метод

Создание библиотеки

Первый этап SELEX — это создание большой библиотеки олигонуклеотидов с фиксированной длиной, но полностью или частично случайными последовательностями. Однако области с вариабельной последовательностью должны быть фланкированы участками с жёстко фиксированной последовательностью, чтобы была возможна их амплификация с помощью ПЦР. Олигонуклеотиды изначально получают путём химического синтеза , а затем амплифицируют с помощью ПЦР так, чтобы каждая случайная последовательность присутствовала в библиотеке во множестве копий. В случае РНК-аптамеров проводят in vitro транскрипцию случайных последовательностей. Высокая копийность каждой случайной последовательности снижает вероятность того, что потенциальный сайт связывания будет утерян в силу стохастических причин. Чтобы олигонуклеотиды смогли приобрести нативную пространственную структуру, их переводят в одноцепочечный вид и лишь после этого инкубируют с лигандом-мишенью .

Инкубация с лигандом

Непосредственно перед добавлением олигонуклеотидов к лиганду библиотеку одноцепочечных олигонуклеотидов нагревают и медленно охлаждают, чтобы они приобрели термодинамически устойчивую вторичную и третичную структуру . Далее библиотеку случайных последовательностей (рандомизированную библиотеку) инкубируют вместе с иммобилизированным лигандом-мишенью, чтобы дать возможность аптамерам связаться с ним. Протоколы инкубации библиотеки с лигандом могут различаться, в частности, могут использоваться различные походы для иммобилизации лигандов, отделения несвязавшихся олигонуклеотидов, различные время и температура инкубации, буферы , в которых происходит инкубация, а также соотношения концентраций олигонуклеотидов и лигандов. Лиганды иммобилизуют на колонках для аффинной хроматографии , нитроцеллюлозных фильтрах или магнитных шариках . Была также разработана разновидность SELEX, в которой в качестве лиганда выступает целая клетка . В этом случае инкубация библиотеки олигонуклеотидов происходит непосредственно в культуральных чашках, в которых растут клетки . Состав буфера, в котором происходит инкубация, зависит от свойств лиганда и требований к аптамерам, успешно прошедшим отбор. Например, если лигандом являются отрицательно заряженные малые молекулы или белки, используются буферы с высокой концентрацией солей, способствующие связыванию аптамера с лигандом. Если же требуется получить аптамер, связывающийся с белком в условиях in vivo или с целой клеткой, который планируется использовать в диагностических или терапевтических целях, то для инкубации используют буферы, по концентрациям солей близкие к плазме крови , а сам процесс проводят при физиологических температурах, чтобы отобранные аптамеры наиболее вероятно связывались с лигандом именно in vivo . Буферы для инкубации также могут содержать неспецифичные вещества-компетиторы. Если есть высокая вероятность того, что олигонуклеотиды, не связывающиеся с лигандом, будут, тем не менее, оставаться в реакционной смеси за счёт неспецифичного связывания с матрицей, то неспецифичные компетиторы (малые молекулы или полимеры , по свойствам близкие к олигонуклеотидам библиотеки) будут препятствовать неспецифическому удержанию неподходящих аптамеров в реакционной смеси . Свойства отобранных аптамеров могут также зависеть от соотношения концентраций лиганда и олигонуклеотидов. Если перед исследователем не стоит задачи получить аптамеры с очень сильным сродством к лиганду, то стоит использовать избыток лиганда, чтобы увеличить вероятность того, что хотя бы какие-то олигонуклеотиды смогут с ним связаться. Однако, если, напротив, необходим высокоспецифичный аптамер, сильно связывающий лиганд, то в избытке нужно брать олигонуклеотиды. Так будут созданы конкуренция между аптамерами и условия для отбора наиболее подходящих из них .

Элюция и амплификация

После того, как библиотека олигонуклеотидов была проинкубирована вместе с лигандом достаточное время, несвязавшиеся олигонуклеотиды вымывают, а связавшиеся при этом остаются связанными с иммобилизованным лигандом . Когда несвязавшиеся последовательности удалены, необходимо элюировать связавшиеся аптамеры, разрушив его связь с иммобилизованным лигандом. Для элюции создают денатурирующие условия, при которых аптамеры теряют свою пространственную структуру, лишаются связей с лигандом и вымываются деионизированной водой . Денатурирующие условия создаются за счёт растворов, содержащих мочевину или ЭДТА , а также под действием высокой температуры или физического воздействия. После элюции высвободившиеся олигонуклеотиды подвергаются обратной транскрипции , если они являются РНК или необходимо введение модифицированных нуклеотидов , а ДНК-нуклеотиды просто собираются для дальнейшей амплификации . Полученные фрагменты ДНК далее амплифицируются с помощью ПЦР и переводятся в одноцепочечную ДНК (оцДНК), РНК или олигонуклеотид с модифицированными основаниями, которые будут использованы для следующего цикла отбора .

Получение оцДНК

Следующий этап SELEX — получение оцДНК, которая будет использована для дальнейшей амплификации с помощью ПЦР. Один из наиболее простых способов получения оцДНК — использование для ПЦР биотинилированных реверсных праймеров, благодаря чему синтезированные комплементарные цепи ДНК будут нести биотин. С помощью биотина их можно закрепить к смоле, а вторую цепь дуплекса элюировать раствором щёлочи . Другой метод для получения оцДНК — , при которой прямой праймер берётся в избытке, а обратный праймер — в очень небольшом количестве, благодаря чему синтезируется больше одноцепочечных фрагментов. Недостаток асимметричной ПЦР заключается в том, что после ПЦР одноцепочечный продукт необходимо очистить от двуцепочечной ДНК и других лишних фрагментов. Ненужные цепи можно разрушить ферментативно , предварительно пометив их так, чтобы её распознавала, к примеру, . Ферменты разрушат ненужную цепь, а целевая оцДНК останется нетронутой .

Отрицательный отбор

Для повышения специфичности аптамеров, отобранных с помощью SELEX, непосредственно до инкубации или сразу после неё можно ввести дополнительный этап — отрицательный отбор. Этот этап нужен для удаления из смеси последовательностей, которые связываются не с лигандом, а с матрицей, на которой он иммобилизован . Отрицательный отбор заключается в добавлении в смесь аналогов лиганда, неспецифичных белков и других молекул, которые собирают на себя все неспецифичные олигонуклеотиды .

Наблюдение за процессом селекции

Чтобы следить за ходом SELEX, можно сравнивать количество молекул лиганда, провзаимодействовавших с аптамерами, которое связано с числом элюированных олигонуклеотидов, с общим количеством олигонуклеотидов, которые теоретически элюируются на каждом этапе. Количество элюированных олигонуклеотидов оценивают, измеряя поглощение при длине волны 260 нм , или с использованием олигонуклеотидов. Когда процесс SELEX подходит к концу, доля олигонуклеотидов, связывающихся с аптамером, доходит до 100 %, и число элюированных олигонуклеотидов становится равным (или несколько меньшим) размеру использовавшейся в инкубации библиотеки .

Химически модифицированные нуклеотиды

В настоящее время в SELEX используются химически модифицированные нуклеотиды. Присутствие химически модифицированных нуклеотидов в олигонуклеотидах может давать дополнительные преимущества потенциальным аптамерам, например, увеличивать их стабильность и устойчивость к нуклеазам , усиливать связывание со специфическими мишенями, изменять физические свойства (например, увеличивать гидрофобность ) и увеличивать количество возможных пространственных структур для данного олигонуклеотида. В SELEX уже были использованы нуклеотиды с неприродными азотистыми основаниями, и в ряде случаев благодаря их использованию удалось получить ДНК-аптамеры с высоким сродством к мишени .

Применение

Пегаптаниб

SELEX был разработан для получения путём направленной эволюции аптамеров с очень высоким сродством к определённым лигандам, в числе которых могут быть и малые молекулы наподобие АТФ и аденозина , а также белки (например, прионы и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) ). SELEX используют для получения аптамеров с высоким сродством и к более сложным структурам, таким как опухолевые клетки . Разрабатываются аптамеры, специфично связывающие опухолевые маркеры , зелёный флуоресцентный белок и родственные ему флуорофоры . Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов уже одобрило VEGF-связывающий аптамер, известный как , для лечения макулодистрофии . SELEX был использован для получения высокоспецифичной (ДНК-зимов). Известно несколько металл -специфичных ДНК-зимов , в числе которых ДНК-зимы, специфичные к меди , урану и натрию . Разрабатываются биосенсоры на основе аптамеров ; кроме того, планируется их использование для флуоресцентного мечения белков и клеток , а также селективного ингибирования ферментов .

Примечания

  1. Oliphant A. R. , Brandl C. J. , Struhl K. (англ.) // Molecular And Cellular Biology. — 1989. — July ( vol. 9 , no. 7 ). — P. 2944—2949 . — doi : . — . [ ]
  2. ↑ Tuerk C. , Gold L. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 1990. — 3 August ( vol. 249 , no. 4968 ). — P. 505—510 . — doi : . — . [ ]
  3. ↑ Ellington A. D. , Szostak J. W. (англ.) // Nature. — 1990. — 30 August ( vol. 346 , no. 6287 ). — P. 818—822 . — doi : . — . [ ]
  4. Blackwell T. K. , Weintraub H. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 1990. — 23 November ( vol. 250 , no. 4984 ). — P. 1104—1110 . — doi : . — . [ ]
  5. Wright W. E. , Binder M. , Funk W. (англ.) // Molecular And Cellular Biology. — 1991. — August ( vol. 11 , no. 8 ). — P. 4104—4110 . — doi : . — . [ ]
  6. Gold L. (англ.) // Journal Of Molecular Evolution. — 2015. — December ( vol. 81 , no. 5-6 ). — P. 140—143 . — doi : . — . [ ]
  7. ↑ Stoltenburg R. , Schubert T. , Strehlitz B. (англ.) // PloS One. — 2015. — Vol. 10 , no. 7 . — P. e0134403—0134403 . — doi : . — . [ ]
  8. ↑ Wu Y. X. , Kwon Y. J. (англ.) // Methods (San Diego, Calif.). — 2016. — 15 August ( vol. 106 ). — P. 21—28 . — doi : . — . [ ]
  9. ↑ Keefe A. D. , Cload S. T. (англ.) // Current Opinion In Chemical Biology. — 2008. — August ( vol. 12 , no. 4 ). — P. 448—456 . — doi : . — . [ ]
  10. ↑ Huizenga D. E. , Szostak J. W. (англ.) // Biochemistry. — 1995. — 17 January ( vol. 34 , no. 2 ). — P. 656—665 . — doi : . — . [ ]
  11. ↑ Iwagawa T. , Ohuchi S. P. , Watanabe S. , Nakamura Y. (англ.) // Biochimie. — 2012. — January ( vol. 94 , no. 1 ). — P. 250—257 . — doi : . — . [ ]
  12. ↑ Vater A. , Jarosch F. , Buchner K. , Klussmann S. (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2003. — 1 November ( vol. 31 , no. 21 ). — P. e130—130 . — doi : . — . [ ]
  13. ↑ Blank M. , Weinschenk T. , Priemer M. , Schluesener H. (англ.) // The Journal Of Biological Chemistry. — 2001. — 11 May ( vol. 276 , no. 19 ). — P. 16464—16468 . — doi : . — . [ ]
  14. Stoltenburg R. , Reinemann C. , Strehlitz B. (англ.) // Biomolecular Engineering. — 2007. — October ( vol. 24 , no. 4 ). — P. 381—403 . — doi : . — . [ ]
  15. Haller A. A. , Sarnow P. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1997. — 5 August ( vol. 94 , no. 16 ). — P. 8521—8526 . — doi : . — . [ ]
  16. Sefah K. , Shangguan D. , Xiong X. , O'Donoghue M. B. , Tan W. (англ.) // Nature Protocols. — 2010. — June ( vol. 5 , no. 6 ). — P. 1169—1185 . — doi : . — . [ ]
  17. Pinheiro V. B. , Taylor A. I. , Cozens C. , Abramov M. , Renders M. , Zhang S. , Chaput J. C. , Wengel J. , Peak-Chew S. Y. , McLaughlin S. H. , Herdewijn P. , Holliger P. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2012. — 20 April ( vol. 336 , no. 6079 ). — P. 341—344 . — doi : . — . [ ]
  18. Dieckmann T. , Suzuki E. , Nakamura G. K. , Feigon J. (англ.) // RNA (New York, N.Y.). — 1996. — July ( vol. 2 , no. 7 ). — P. 628—640 . — . [ ]
  19. Burke D. H. , Gold L. (англ.) // Nucleic Acids Research. — 1997. — 15 May ( vol. 25 , no. 10 ). — P. 2020—2024 . — doi : . — . [ ]
  20. Mercey R. , Lantier I. , Maurel M. C. , Grosclaude J. , Lantier F. , Marc D. (англ.) // Archives Of Virology. — 2006. — November ( vol. 151 , no. 11 ). — P. 2197—2214 . — doi : . — . [ ]
  21. ↑ Ulrich H. , Trujillo C. A. , Nery A. A. , Alves J. M. , Majumder P. , Resende R. R. , Martins A. H. (англ.) // Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. — 2006. — September ( vol. 9 , no. 8 ). — P. 619—632 . — . [ ]
  22. Daniels D. A. , Chen H. , Hicke B. J. , Swiderek K. M. , Gold L. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 2003. — 23 December ( vol. 100 , no. 26 ). — P. 15416—15421 . — doi : . — . [ ]
  23. Ferreira C. S. , Matthews C. S. , Missailidis S. (англ.) // Tumour Biology : The Journal Of The International Society For Oncodevelopmental Biology And Medicine. — 2006. — Vol. 27 , no. 6 . — P. 289—301 . — doi : . — . [ ]
  24. Paige J. S. , Wu K. Y. , Jaffrey S. R. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2011. — 29 July ( vol. 333 , no. 6042 ). — P. 642—646 . — doi : . — . [ ]
  25. Vavvas D. , D'Amico D. J. (англ.) // Ophthalmology Clinics Of North America. — 2006. — September ( vol. 19 , no. 3 ). — P. 353—360 . — doi : . — . [ ]
  26. Breaker R. R. , Joyce G. F. (англ.) // Chemistry & Biology. — 1994. — December ( vol. 1 , no. 4 ). — P. 223—229 . — . [ ]
  27. Carmi N. , Shultz L. A. , Breaker R. R. (англ.) // Chemistry & Biology. — 1996. — December ( vol. 3 , no. 12 ). — P. 1039—1046 . — . [ ]
  28. Liu J. , Brown A. K. , Meng X. , Cropek D. M. , Istok J. D. , Watson D. B. , Lu Y. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 2007. — 13 February ( vol. 104 , no. 7 ). — P. 2056—2061 . — doi : . — . [ ]
  29. Torabi S. F. , Wu P. , McGhee C. E. , Chen L. , Hwang K. , Zheng N. , Cheng J. , Lu Y. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 2015. — 12 May ( vol. 112 , no. 19 ). — P. 5903—5908 . — doi : . — . [ ]
  30. Lubin A. A. , Hunt B. V. , White R. J. , Plaxco K. W. (англ.) // Analytical Chemistry. — 2009. — 15 March ( vol. 81 , no. 6 ). — P. 2150—2158 . — doi : . — . [ ]
  31. Umrao Saurabh , Jain Vasundhara , Chakraborty Banani , Roy Rahul. (англ.) // Sensors and Actuators B: Chemical. — 2018. — August ( vol. 267 ). — P. 294—301 . — ISSN . — doi : . [ ]
  32. Terazono H. , Anzai Y. , Soloviev M. , Yasuda K. (англ.) // Journal Of Nanobiotechnology. — 2010. — 13 April ( vol. 8 ). — P. 8—8 . — doi : . — . [ ]
  33. Mondragón E. , Maher LJ 3rd. (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2015. — 3 September ( vol. 43 , no. 15 ). — P. 7544—7555 . — doi : . — . [ ]
Источник —

cathleen
  • 2021-02-01
  • 1
  • Tags:

Same as Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением

The title for the last searches