Ана-телофазный анализ — генетический тест, основанный на визуальном учёте хромосомных аберраций (повреждения хромосом) на стадии анафазы и телофазы митотического цикла клетки . Ана- телофазный анализ — простой, экономичный метод, который не требует знания кариотипа и идентификации хромосом. Он позволяет выявить лишь определенные типы хромосомных аберраций , но его чувствительность вполне достаточна для заключения « мутагенен » или « не мутагенен » фактор. Ана- телофазный анализ является достаточно чувствительным, корректным и удобным на первом этапе экотоксикогенетического исследования .

История

Выбросы генотоксикантов в окружающую среду в результате антропогенной активности людей порождают необходимость в подходящих генетических тестах, чтобы оценить потенциальное воздействие данных факторов на экосистемы. Ана- телофазный анализ был описан как экспрессный и экономичный генетический тест. Среди наиболее ранних исследований, в которых данный анализ был применен, следует отметить эксперименты на луке ( A. Levan ). До настоящего времени применяется как основной метод генетического анализа для растительной тест-системы Allium test , в которой исследуется влияние различных генотоксикантов на клетки корневых меристем .

Чувствительность и применимость

Ана-телофазный анализ высокочувствителен при тестах самой разной направленности. Будь то пробы субстратов из окружающей среды ( вода , почва , донные отложения ) или же вещества антропогенного происхождения, а также излучения различного спектра (как ионизирующие, так и неионизирующие). Кроме того достоинством данного анализа является его универсальность (он применим практически во всех случаях, когда идёт митоз ) и простота в приготовлении препаратов, что очень важно при работе с клетками животных . Ана-телофазный анализ хромосомных аберраций на клетках лука ( Allium cepa ), рекомендован как инструмент цитомониторинга окружающей среды. Путём измерения генотоксичности, он способствует оценке степени экологического риска от средств бытового и промышленного назначения, постоянно внедряемых и становящихся все более важными в повседневной жизни .

Техника проведения анализа

Включает анализ под микроскопом препарата клеток, зафиксированных и окрашенных на стадии пролиферации . Существует ряд вариаций ана- телофазного анализа. Так, согласно оригинальному варианту анализа, описанному Fiskesjo ( 1985 г.) на препарате подсчитываются первые 100 анафазных и телофазных клеток, из которых отмечаются аберрантные . Позднее стал применяться иной вариант И. М. Прохорова и соавт. (2003), который учитывает все анафазы и телофазы на препарате, среди которых отмечаются аберрантные . Пригодными для учёта хромосомных аберраций являются не очень ранние анафазы и ранние телофазы . Поскольку делящаяся клетка не всегда распластывается на препарате по продольной оси деления, то при отборе клеток, пригодных для подсчета хромосомных аберраций, надо принимать во внимание расстояние между дочерними ядрами — оно должно быть не меньше размера одного из них .

Типы анализируемых аберраций

На стадии анафазы и телофазы подсчитываются две классические для данного анализа категории аберраций, представляющие собой отставший от полюсов хромосомный материал (ацентрические фрагменты и кольца, отставшие хромосомы) и мосты. Все они достаточно хорошо видны визуально и различимы. Очень часто в отдельную категорию включаются и подсчитываются отставания и забегания, указывающие на изменения ахроматинового веретена деления.

1. Ацентрические фрагменты и кольца могут быть одиночными и парными. Они располагаются между дочерними звёздами или в стороне от них. Основная задача сводится к распознаванию одиночности или парности и к отличию их от отставших хромосом. Одиночные фрагменты представляют собой фрагменты хроматидного происхождения. Потеря одного фрагмента из пары (хромосомного происхождения) — явление, очевидно, редкое, поскольку притяжение между сестринскими хроматидами сохраняется и на стадии анафазы. По этой же причине маловероятно предположение, что одиночный фрагмент может происходить за счет слияния сестринских хроматид парного фрагмента и развёртывания их по длине.
2. Парные фрагменты — это фрагменты изохроматидного или хромосомного происхождения. О соединении повреждённых концов сестринских хроматид, а не об отставшей хромосоме можно говорить только при условии, если парный фрагмент имеет дугообразный вид. Следует отметить, что оценка этого признака крайне затруднительна и поэтому не может проводиться во всех случаях.
3. Мосты иногда разделяют на хромосомные и хроматидные. Под хромосомным мостом понимают дицентричческую хромосому: он состоит из двух хроматид, чаще всего перекрещённых. Хроматидный мост — дицентрическая хроматида, поэтому он виден как одиночный. По «толщине» моста нельзя судить о его хромосомном или хроматидном характере. Не всегда можно дифференцировать зарактер моста и поэтому вряд ли целесообразно проводить такое разделение при использовании тотального метода окрашивания хромосом, не позволяющего идентифицировать отдельные хроматиды.
4. Отставшие хромосомы или хроматиды чаще всего распознаются легко, так как в них можно видеть центромеру либо неоднородность структуры, что нехарактерно для фрагментов. Наибольшие трудности возникают при необходимости отличить отставшую метацентрическую хроматиду от акроцентрической хромосомы. Вместе с тем ответ на этот вопрос важен, потому что в результате отставания хромосомы образуются две гипоплоидные клетки, а в результате отставания хроматиды одна гипоплоидная и одна нормальная клетка.

Абсолютного стандарта для учёта аберраций и для представления полученных результатов быть не может. На практике встречаются сочетания разных типов аберраций в одной и той же клетке. Теоретически можно ожидать любые сочетания аберраций. Основой этого является асинхронность редупликации наследственного материала. Кроме того попутно другие, реже встречающиеся типы аберраций, такие как мультиполярные митозы и полиплоидии, так же могут регистрироваться .

Расчет частоты мутаций

Обозначение	Характеристика	Расчёт
ХА+отс.	ХА+отс., % — частота хромосомных аберраций и отставаний Частота хромосомных аберраций и отставаний — рассчитывается как отношение суммы ана - и телофазных клеток, в которых были зарегистрированы нарушения, к общему числу проанализированных ана-телефаз.	${\displaystyle {\mbox{XA+otc.}}={\frac {\mbox{(XA+otc.)}}{\mbox{N(A+T)}}}*100\%}$ , где XA+отс. — сумма аберрантных клеток, находящихся на стадии ана - и телофазы , а N(А+Т) — общее число проанализированных анафаз и телофаз на препарате.

Преобразование

Частота хромосомных аберраций и отставаний может быть представлена в виде выраженности мутагенного эффекта, согласно системе интегральной оценки мутагенного эффекта.

Рекомендации по проведению ана- телофазного анализа

Для большинства исследований можно рекомендовать следующее:

1. Важным условием при оценке типов (спектра и частоты хромосомных аберраций) является проведение их учёта в первом после действия мутагена клеточном делении. Это связано с тем, что значительная часть аберраций и аберрантных клеток элиминируется уже после первого деления или приобретает другой вид, хотя некоторые хромосомные аберрации, которые наблюдаются в виде мостов, могут сохраняться в течение 12—15 митотических циклов.
2. Не проводить анализ перестроек при наложении клеток и при нарушении целостности их оболочки.
3. Принимать во внимание все типы морфологических изменений, учёт которых возможен при данной методике.
4. Анализировать изменения поклеточно, то есть регистрировать в протоколе опытов сочетаемость аберраций, встречающихся в каждой клетке.
5. Клетки, в которых не удается определить тип аберраций, нужно относить к классу клеток с неразобранными аберрациями; их подсчитывать только в подсчёте общего количества аберрантных клеток.
6. Быть крайне осторожным при объединениях любого рода (например, данных по отдельным повторностям и данных аналогичных опытов, по точечным фрагментам и кольцам, по дицентрикам и сопутствующим ацентрикам и т. д.). Если правомочность какого-то объединения доказана для некоторого объекта или условий, то для других объектов и условий она должна специально проверяться.
7. При представлении данных в статье необходимо указывать число обследованных особей (или повторностей опыта), число проанализированных клеток, число каждого из учитываемых типов аберраций, типы аберрантных клеток и их частоту, число анеуплоидных клеток.

Для точного определения необходимо знать структуру кариотипа изучаемого вида растений или животных в норме .

Методы и объекты на основе данного метода

• Allium test
• Vicia test

См. также

• Метафазный анализ
  • Allium test
• Митотический индекс
• Хромосомные перестройки

Примечания

Ссылки

• Песня Д.С., Романовский А.В. : Научно-практические пособие. — Москва: JRE – ИРЭ им. В.А.Котельникова РАН, 2010. — С. 929 .