Interested Article - Вложенная полимеразная цепная реакция

Вложенная полимеразная цепная реакция ( англ. nested PCR — «вложенная» ПЦР) — двухстадийная вариация ПЦР , используемая для снижения количества неспецифичных продуктов реакции . На первой стадии амплифицируется участок, включающий в себя целевой фрагмент ДНК и фланкирующие его последовательности (то есть расположенные по краям фрагмента), к которым отжигается первая пара праймеров . На второй стадии добавляются праймеры, комплементарные концам целевого фрагмента. Так как продукт первого этапа содержит в себе целевой фрагмент (то есть конечный продукт внутри продукта первой стадии), данная вариация ПЦР называется вложенной .

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это процесс амплификации ДНК с использованием фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы . Такая реакция нашла широкое применение в генетических лабораториях для выявления наличия в образцах определённого участка ДНК или РНК (во втором случае необходимо предварительно перевести РНК в ДНК реакцией обратной транскрипции ). Также ПЦР используется в генной инженерии для получения необходимого фрагмента и его дальнейшего использования в клонировании , in vitro транскрипции и других целях. Важным этапом подготовки реакции является выбор праймеров, отжигаемых на концах целевого фрагмента. Нередко при этом праймеры отжигаются и на другие участки ДНК, приводя к смеси продуктов. Вероятность такого произойти возрастает с увеличением количества циклов ПЦР .

Праймеры

Во вложенной ПЦР используются две пары праймеров, добавляемые на двух последовательных этапах реакции. Первая пара называется внешней и служит для начальной амплификации участка, включающего в себя целевой фрагмент ДНК, при этом на данном этапе используется небольшое число температурных циклов (от 15 до 30). Вторая пара, называемая внутренней, отжигается на продукт первой и используется на втором этапе ПЦР с большим числом температурных циклов. Так как после первой стадии количество ДНК, содержащей целевой фрагмент, экспоненциально возрастает , а праймеры, используемые на каждом этапе, комплементарны разным последовательностям вокруг целевого участка ДНК, итоговая специфичность реакции увеличивается. Такой подход часто используется для получения редких фрагментов или участков низкой сложности (например, GC-богатых последовательностей) .

Этапы реакции и протокол

Протокол проведения вложенной ПЦР был впервые описан в 1993 году Kamolvarin и коллегами для диагностики бешенства . С тех пор последовательность действий сохранилась практически без изменений . Ниже описан оригинальный протокол из статьи.

Первый этап

После выделения РНК была проведена обратная транскрипция с использованием 50 пкмоль каждого из пары внешних праймеров для 1 мкг материала. После смесь, содержащая РНК/ кДНК -гибрид и праймеры, была доведена до 50 мкл с помощью ПЦР буфера, содержащего 1,25 ед. Taq-ДНК-полимеразы и 62,5 мкмоль/л дДНФ ( дезоксирибонуклеозидтрифосфат ). На смесь наслоили сверху 50 минерального масла и провели 30 циклов ПЦР (94 °С, 1 мин (плавление); 45 °С, 2 мин (отжиг); 72°С, 2,5 мин (элонгация)) .

На первом этапе внешняя пара праймеров, комплементарная участкам вокруг целевого фрагмента ДНК, используется для амплификации данного фрагмента. Помимо целевого участка праймеры также могут отжечься и на другие участки. Итоговая смесь продуктов первого этапа включает в себя как целевую ДНК, так и примеси .

Второй этап

Для проведения второго этапа вложенной ПЦР отобрали аликвоту в 2 мкл из первой смеси и добавили к 23 мкл смеси, содержащей по 20 пкмоль внутренних праймеров, комплементарных участкам самого целевого фрагмента, 25 ммоль/л дДНФ и 1 ед Taq ДНК полимеразы. Провели 30 циклов амплификации с той же программой, что и в первом этапе .

При этом вероятность отжига праймеров на другие продукты первого этапа крайне низка и в большинстве случаев амплифицируется лишь целевой фрагмент ДНК .

Примеры использования

Вложенная ПЦР широко используется в задачах, требующих высокой специфичности, как-то: тест-системы , работа с малыми количествами материала , очистка образцов ДНК для их дальнейшего анализа и использования .

Конкретные случаи применения вложенной ПЦР:

детекции паразита Erwinia amylovora в бессимптомных клетках растений или в плодах граната
детекции норовируса 1 геногруппы в устрицах или трихомонад в лёгких человека
детектирования человеческого Т-клеточного лимфотрофного вируса I/II типа
создания высокочувствительной для диагностики туберкулёзного менингита
приготовления библиотек Т-клеток для высокопроизводительного секвенирования

Примечания

↑ Shen Chang-Hui. (англ.) // Diagnostic Molecular Biology. — 2019. — P. 215—247 . — ISBN 9780128028230 . — doi : . [ ]
↑ Haff L A. (англ.) // Genome Research. — 1994. — 1 June ( vol. 3 , no. 6 ). — P. 332—337 . — ISSN . — doi : . [ ]
↑ Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. (англ.) // Journal of Infectious Diseases. — 1993. — 1 January ( vol. 167 , no. 1 ). — P. 207—210 . — ISSN . — doi : . [ ]
Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. . — [Dordrecht]: Springer, 2008. — 1 online resource (325 pages) с. — ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9, 978-1-4020-6240-7, 1-4020-6240-0, 1-281-24237-3, 978-1-281-24237-2.
↑ Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. (англ.) // PLOS ONE. — 2017. — 30 October ( vol. 12 , no. 10 ). — P. e0186985 . — ISSN . — doi : . [ ]
↑ Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. (англ.) // Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. — 2004. — June ( vol. 99 , no. 4 ). — P. 377—380 . — ISSN . — doi : . [ ]
↑ Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. (англ.) // Frontiers in Immunology. — 2013. — Vol. 4 . — ISSN . — doi : . [ ]
Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. (англ.) // Applied and Environmental Microbiology. — 2000. — 1 May ( vol. 66 , no. 5 ). — P. 2071—2078 . — ISSN . — doi : . [ ]
Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. (англ.) // Scientific Reports. — 2017. — 20 January ( vol. 7 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. (англ.) // Molecular and Cellular Probes. — 2018. — August ( vol. 40 ). — P. 40—43 . — ISSN . — doi : . [ ]
Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. (англ.) // BMC Infectious Diseases. — 2019. — 10 June ( vol. 19 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]