Interested Article - Протеиназа K
ayesha
- 2020-06-04
- 1
Протеиназа K (протеаза K , эндопептидаза K ; КФ ) — сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album ( Tritirachium album ) .
Протеиназа К способна расщеплять кератин , основной белок волос, откуда и получила своё название. Основные участки в пептиде, распознаваемые и гидролизуемые протеиназой, — пептидные связи, соседствующие с карбоксильной группой алифатических и ароматических аминокислот с закрытой альфа-амино-группой. Широко используется благодаря её широкой специфичности.
Структура
Протеиназа К состоит из 384 аминокислот и содержит два сайта связывания ионов Ca 2+ , которые расположены вблизи активного центра. Для ферментативной активности требует присутствие ионов Ca 2+ (1 — 5 mM), однако они не принимают непосредственного участия в каталитической реакции.
Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобные аминокислоты). Длительная инкубация белков с протеиназой K, также как и при высокой концентрации фермента, приводит к их полному гидролизу . Удаление ионов Ca 2+ снижает стабильность фермента и его каталитическую активность на 80 %, но остаточная активность сохраняется , поэтому протеиназу К можно использовать для очистки нуклеиновых кислот от белков в присутствии ЭДТА .
Активность протеиназы К
В молекулярной биологии протеиназа К широко применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК .
Повышение температуры реакции с 37 °C до 60 °C увеличивает активность протеиназы K в несколько раз, как и при добавление 0,5 — 1 % SDS или (3 M) или (1 M) или мочевины (4 M) . Так как повышается доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.
Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум — pH 8.
Температура выше 65 °C или присутствие трихлоруксусной кислоты или сериновых протеаз-ингибиторов AEBSF, PMSF или DFP ингибируют активность.
Протеиназа К не ингибируется в присутствии (до 3 M), (до 1 M), мочевины (до 4 M), Sarkosyl , Triton X-100 , , SDS , EDTA , цитрат , йодуксусной кислоты, а также в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, как Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) и Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK).
Активность протеиназы К в стандартных буферах
| Буфер (pH 8.0, 50°C, 1.25 мкг/мл протеиназы К, 15 мин инкубации) | Активность протеиназы К (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris·Cl | 100 |
| 30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5 % ; 0,5 % Triton X-100 ; 800 mM | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5 % ; 0,36 % Triton X-100 ; 735 mM | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,5 % SDS | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1 % Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl 2 ; 0,45 % ; 0,5 % Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0,5 % SDS | 120 |
| 30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1 % SDS | 203 |
Примечания
- Betzel C., Singh T.P., Visanji M., et al. (англ.) // Journal of Biological Chemistry : journal. — 1993. — July ( vol. 268 , no. 21 ). — P. 15854—15858 . — . 17 февраля 2016 года.
- Ebeling W., Hennrich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. (англ.) // : journal. — 1974. — Vol. 47 , no. 1 . — P. 91—97 . — doi : . — .
- Müller A., Hinrichs W., Wolf W.M., Saenger W. (англ.) // Journal of Biological Chemistry : journal. — 1994. — Vol. 269 . — P. 23108—23111 . — . 18 февраля 2016 года.
- Hilz H., Wiegers U., Adamietz P. (англ.) // : journal. — 1975. — Vol. 56 , no. 1 . — P. 103—108 . — doi : . — .
ayesha
- 2020-06-04
- 1
