Протеиназа K (протеаза K , эндопептидаза K ; КФ ) — сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album ( Tritirachium album ) .

Протеиназа К способна расщеплять кератин , основной белок волос, откуда и получила своё название. Основные участки в пептиде, распознаваемые и гидролизуемые протеиназой, — пептидные связи, соседствующие с карбоксильной группой алифатических и ароматических аминокислот с закрытой альфа-амино-группой. Широко используется благодаря её широкой специфичности.

Структура

Протеиназа К состоит из 384 аминокислот и содержит два сайта связывания ионов Ca ²⁺ , которые расположены вблизи активного центра. Для ферментативной активности требует присутствие ионов Ca ²⁺ (1 — 5 mM), однако они не принимают непосредственного участия в каталитической реакции.

Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобные аминокислоты). Длительная инкубация белков с протеиназой K, также как и при высокой концентрации фермента, приводит к их полному гидролизу . Удаление ионов Ca ²⁺ снижает стабильность фермента и его каталитическую активность на 80 %, но остаточная активность сохраняется , поэтому протеиназу К можно использовать для очистки нуклеиновых кислот от белков в присутствии ЭДТА .

Активность протеиназы К

В молекулярной биологии протеиназа К широко применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК .

Повышение температуры реакции с 37 °C до 60 °C увеличивает активность протеиназы K в несколько раз, как и при добавление 0,5 — 1 % SDS или (3 M) или (1 M) или мочевины (4 M) . Так как повышается доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.

Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум — pH 8.

Температура выше 65 °C или присутствие трихлоруксусной кислоты или сериновых протеаз-ингибиторов AEBSF, PMSF или DFP ингибируют активность.

Протеиназа К не ингибируется в присутствии (до 3 M), (до 1 M), мочевины (до 4 M), Sarkosyl , Triton X-100 , , SDS , EDTA , цитрат , йодуксусной кислоты, а также в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, как Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) и Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK).

Активность протеиназы К в стандартных буферах

Буфер (pH 8.0, 50°C, 1.25 мкг/мл протеиназы К, 15 мин инкубации)	Активность протеиназы К (%)
30 mM Tris·Cl	100
30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5 % ; 0,5 % Triton X-100 ; 800 mM	313
36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5 % ; 0,36 % Triton X-100 ; 735 mM	301
10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,5 % SDS	128
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1 % Sarkosyl	74
10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl 2 ; 0,45 % ; 0,5 % Triton X-100	106
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0,5 % SDS	120
30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1 % SDS	203

Примечания