Вирус Сендай , или вирус парагриппа мышей , или вирус парагриппа 1 ( лат. Murine respirovirus , ранее Sendai virus ), — вид вирусов из семейства парамиксовирусов . Вирус является цитоплазматическим . Его геном , который представлен однонитевой нефрагментированной (-) РНК длиной 15 384 нуклеотидов, реплицируется в цитоплазме . Вирионы имеют сферическую форму размером 150—250 нм . Вирус Сендай вызывает легко передающуюся инфекцию дыхательных путей у мышей, хомяков, морских свинок и крыс. Случаи инфекционных заболеваний, вызванные этим вирусом у человека, кошек, собак или сельскохозяйственных животных, не зарегистрированы. Вирус Сендай широко распространен в природе и встречается в мышиных колониях по всему миру .

Структура вириона

Вирус Сендай является оболочечным вирусом: внешний слой представлен липидной оболочкой, в которой находятся: гликопротеин Гемагглютинин-Нейроминидаза (HN) с двумя ферментативными активностями ( гемагглютинирующей и нейраминидазной ), которые необходимы для адсорбции вируса на поверхности клетки-хозяина. Гликопротеин HN является мощным индуктором интерферона 1-го типа. В липидной оболочке вируса также находится белок слияния (F), который тоже является гликопротеином и обеспечивает проникновение вируса в клетки-хозяева после вирусной адсорбции. Белок F- производится в клетке в неактивной форме, однако, за счет протеаз, производимых клетками хозяевами, он расщепляется и превращается в биологически активную форму . Под липидной мембраной расположен матриксный белок (M), он формирует внутренний слой оболочки вируса. Вирус также содержит геномную РНК в комплексе с тремя белками, а именно Нуклеопротеином (NP), Фосфопротеином (P) и Полимеразой (L) .

Структура генома

Геном вируса Сендай представляет собой несегментированную РНК отрицательной полярности длиной 15384 нуклеотида и содержит некодирующие 3-штрих и 5-штрих области длиной около 50 нуклеотидов. Они являются цис-элементами, необходимыми для репликации (как и у других респировирусов из семейства Paramyxoviridae). Последовательность генов вируса Сендай выглядит следующим образом: три штрих-N-P-M-F-HN-L-пять штрих. Эти гены кодируют соответственно белок нуклеокапсида (N), малую субъединицу РНК-полимеразы или фосфопротеин (P), матриксный белок (M), белок слияния (F), гемагглютинин-нейраминидазу (HN) и большую субъединицу РНК-полимеразы (L). Дополнительные белки, которые часто называют неструктурными или вспомогательными белками, закодированы в альтернативных рамках считывания гена Р.  Матричная РНК вируса Сендай P/C содержит пять участков инициации рибосом между позициями 81 и 201 с 5-штрих конца. Один из этих сайтов находится в открытой рамке считывания белка P, тогда как четыре других представляют собой вложенный набор белков C (C-штрих, C, Y1, Y2). Вирус Сендай использует рибосомное шунтирование для экспрессии белков Y1 и Y2, которые инициируются соответственно на четвёртом и пятом старт-кодонах P/C мРНК. В таких P/C мРНК также закодированы дополнительные белки. Два из них, V и W, являются продуктами редактирования мРНК в кодоне 317 (котранскрипционно добавляются соответственно один или два гуаниловых нуклеотида). Третий – Х-белок – представляет собой C-концевые 95 аминокислот белка Р. Его синтез инициируется рибосомами независимо. Все эти белки являются неструктурными и выполняют несколько функций, включая организацию синтеза вирусной РНК и помощь в избегании врождённого иммунитета хозяина. Также было обнаружено, что белок C способствует почкованию вирусных частиц, а небольшие количества белка C связаны с вирусным капсидом.

Клеточное сливание (образование синцития)

Одной из интересных особенностей вируса Сендай является способность индуцировать образование синцитиев (многоядерных клеточных образований) в природных условиях и в клеточных культурах. Некоторые представители парамиксовирусов, включая вирус Сендай, выработали механизм распространения инфекции путем слияния инфицированных и неинфицированных клеток. При таком распространении инфекции вирус избегает нейтрализующих антител организма хозяина. Механизм этого процесса достаточно хорошо изучен, он похож на процесс слияния, используемый вирионом для проникновения в клетку. Функционирование двух вирусных гликопротеинов HN и F необходимо для обеспечения прохождения этого процесса . Свойство вируса Сендай сливать мембраны клеток с образованием синцития было использовано учеными для производства гибридом и моноклональных антител . Авторами изобретения являются Жорж Кёлер и Сесар Мильштейн . Они опубликовали соответствующую статью в 1975 году , а в 1984 году за свое изобретение они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине . С тех пор были найдены более эффективные методы создания клеточных гибридов , однако первые гибридомы были получены с помощью вируса Сендай.

Применение

Использование в производстве лейкоцитарного интерферона

Вирус Сендай обладает свойством индуцировать продукцию интерферона альфа в лейкоцитах животных и человека. Это свойство вируса используется для промышленного производства интерферона из лейкоцитов , полученных из донорской крови. Предложение о таком использовании вируса и экспериментальное доказательство такой возможности было сделано в научной работе Кари Кантелла опубликованной в 1981 году .Лейкоцитарный интерферон является лекарственным препаратом .

Потенциальное использование вируса как онколитического агента

Одним из преимуществ вируса Сендай как потенциального онколитического агента является его безопасность. Несмотря на то, что вирус, в течение десятилетий, широко использовался в лабораторных исследованиях во всем мире, он никогда не провоцировал заболеваний у человека. Более того, вирус Сендай, в процессе клинических испытаний, после закапывания в нос взрослым и детям, не вызывал существенных побочных эффектов, но иммунизировал испытуемых к вирусу человеческого парагриппа 1-го типа . Это связано с тем, что вирус Сендай и вирус человеческого парагриппа 1 вызывают образование перекрестных антител . Ряд работ, проведенных в Японии, показал, что видоизмененный генно-инженерными методами, вирус Сендай может интенсивно распространяться в опухолевых клетках и уничтожать их, не затрагивая окружающие их нормальные клетки. Онколитическое действие вируса приводило к подавлению роста опухолей, состоящих из клеток человека у лабораторных животных. Новообразования на которые воздействовал вирус Сендай включают опухоли образованные клетками фибросаркомы , рака толстой кишки, поджелудочной железы и мозга . Также было показано, что рекомбинантный вирус Сендай с высокой эффективностью уничтожает опухоли меланомы, нейробластомы , плоскоклеточного рака, рака печени и простаты . Кроме того, после инактивации ультрафиолетом, при внутриопухолевом введении, вирус Сендай часто оказывал иммуностимулирующее действие. Это действие помогало вирусу подавлять рост опухолей у модельных животных, включая, рак толстой кишки , мочевого пузыря , почки и простаты . Описаны полные и частичные ремиссии опухолей тучных клеток (мастоцитом) у собак вызванные исключительно введением немодифицированного вируса Сендай . Кратковременная ремиссия после внутривенной инъекции живого вируса Сендай была описана у пациента с острой лейкемией в США в 1964 году . Подробно механизмы противоракового действия вируса Сендай описаны в обзорной работе под названием "Механизмы онколитического действия парамиксовируса Сендай" .

Применение вируса Сендай в качестве вектора

Вирус Сендай известен научному сообществу более 60 лет. Почти все это время он активно использовался как модельный патоген в молекулярно биологических исследованиях. За последние три десятилетия интерес ученых был сфокусирован на этом вирусе как векторе для создания разнообразного набора генно-инженерных конструктов, включая конструкты для доставки трансгенов в клетку . За счет того, что репликация вируса происходит исключительно в цитоплазме, риск генетической интеграции вирусного генома в геном хозяина отсутствует, такая интеграция является проблемой для многих других вирусных векторов.

Добавление, удаление и модификация генов

Рекомбинантные варианты вируса Сендай были созданы путем удаления некоторых вирусных генов таких как белок сливания, матриксный белок и белок геммагглютинин-нейраминидазы так и путем введения в вирусный геном новых генов . Вирусные конструкты так же создавались и путем модифиции в геноме вируса коротких участков ДНК. Например, был модифицирован фрагмент ДНК, кодирующий вирусный белок сливания (F) . Белок сливания представляет собой мембранный гликопротеин типа I, который синтезируется в качестве неактивного предшественника (F0). Этот предшественник должен активироваться протеолитическим расщеплением по остатку аргинина-116 . После расщепления предшественник F0 дает две дисульфид-связанные субъединицы F1 и F2. В некоторых генно-инженерных экспериментах сайт протеолитического расщепления F0 изменяли, что приводило к тому, что изменялся набор протеаз-клетки хозяина которые были способны  разрезать и активировать F0 . В результате, менялась тропность вируса. Он мог размножаться только в тех клетках, которые экспрессировали соответствующие протеазы .

Визуализация вирусной инфекции в клетке и в организме

Для того чтобы наблюдать за инфекцией и распространением вируса Сендай прямо, непосредственно у живого животного был создан набор различных рекомбинантных конструктов . Они позволяют изучать как динамику распространения вируса, так и его исчезновения в процессе выздоровления животного. Некоторые конструкты были созданы для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) . Один из них, rSeV-GFP4, доступен коммерчески и имеется . Некоторые другие конструкты были созданы для экспрессии красного флуоресцентного белка RFP . Кроме того, были созданы конструкты для экспрессии гена люциферазы .

Перепрограммирование в индуцированные стволовые клетки (иСК)

Одним из вариантов применения векторных конструктов на основе вируса Сендай является перепрограммирование соматических клеток в иСК . Полученные перепрограммированные клетки  в конечном счете не экспрессируют трансгены . Система для такого перепрограммирования доступна для приобретения от ThermoFisher Scientific как CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit, каталожный номер: A34546 .

Применение вируса Сендай в качестве вектора для создания вакцины

Вирус Сендай имеет несколько особенностей, которые необходимы для векторной системы, на основе которой может быть создана эффективная вакцина: вирус не интегрируется в геном хозяина, он не подвергается генетической рекомбинации и он реплицируется только в цитоплазме без промежуточных генетических продуктов в ядре клетки. Вирус Сендай, как и все другие представители семейства парамиксовирусов эволюционирует очень медленно и генетически стабилен. Геном вируса чрезвычайно похож на геном вируса парагриппа человека 1 (Human Para-influenza Virus -1 (HPIV-1)), и оба вируса имеют общие антигенные детерминанты. В качестве вакцины для иммунизации против HPIV-1 вирус Сендай дикого типа использовался в клинических испытаниях с участием как взрослых , так и детей . Вирус закапывали испытуемым в нос в дозах в диапазоне от 5 × 10 ⁵ до 5 × 10 ⁷ 50%  инфекционной эмбриональной дозы. Такого рода вакцинация приводила к выработке нейтрализующих антител к вирусу парагриппа человека 1 и не вызывала каких-либо ощутимых побочных эффектов. На основании этих испытаний можно заключить, что вирус Сендай безопасен для людей.

На основе вектора вируса Сендай разрабатывается вакцина против СПИДа . Эта разработка достигла второй фазы клинических испытаний. Большинство людей в детстве переболевают вирусом парагриппа 1, поэтому они во взрослом состоянии обычно имеют антитела к HPIV-1. Поскольку антитела к вирусу Сендай, перекрестны с антителами к HPIV-1, то они присутствуют у большинства людей, однако при этом не имеют высокого титра. Исследование, которое было опубликовано в 2011 году, продемонстрировало, что нейтрализующие антитела к вирусу Сендай (которые образовались в результате перенесенной HPIV-1 инфекции) могут быть обнаружены у 92,5% людей во всем мире со средним титром EC50 60,6 и значениями в диапазоне от 5,9 до 11,324 . Таким образом, эти антитела не должны помешать выработке иммунного ответа против вируса иммунодефицита, после применения вакцины сделанной на основе вируса Сендай . Подробно о преимуществах вируса Сендай как вакцинного вектора для возможной вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 можно прочитать в работе "Обзор технологий для создания вакцин против бетакоронавирусов и вирус Сендай как возможный вакцинный вектор" которая была опубликована в журнале "Молекулярная Биология" .

Примечания

Литература

• , Хоу Юнь-дэ. / Акад. мед. наук СССР. — М. : Медицина , 1964. — 196 с.