Interested Article - Гибридизация ДНК

Гибридизация ДНК , гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК- РНК .

Протокол эксперимента

Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере . Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.
Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.
Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК гибридизуются друг с другом (образуются водородные связи между комплементарными основаниями) и образуется «гибридная» молекула ДНК.

Анализ скорости отжига (= гибридизации) одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.

Вычисление температуры плавления ДНК

Вторичная структура ДНК играет важную роль в биологии, генетической диагностике и других методах молекулярной биологии и нанотехнологии. Поэтому точное определение температуры плавления молекул ДНК или РНК играет самую главную роль во всех молекулярно-биологических методах, например, при подборе проб или олигонуклеотидов для микрочипов или при подборе праймеров для ПЦР . Существует несколько простых формул вычисления температуры плавления для коротких олигонуклеотидов. Грубое вычисление температуры плавления (T _m ) короткого олигонуклеотида (<20 нуклеотидов ) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C — сумма всех гуанинов и цитозинов , L — длина олигонуклеотида):

$T_{m}=2(L+G+C)$ ,

Усредненная формула подсчета T _m для короткого олигонуклеотида (и для длинных фрагментов ДНК) с учётом концентрации ионов K ⁺ и DMSO :

$T_{m}=77.1+11.7\lg[K^{+}]+{\frac {41(G+C)-528}{L}}-0.75[\%DMSO]$ ,

Однако эти уравнения не учитывают инициацию связывания при гибридизации олигонуклеотида, не учитывают особенности самой последовательности и концевого эффекта, характерный для олигонуклеотидных дуплексов. Поэтому данная формула пригодна в большей степени, где последовательность ДНК усредненная и длина дуплексов свыше 40 нуклеотидов.

Термодинамика ДНК

Наиболее распространенный метод, используемый сегодня для расчета температуры плавления двухцепочечной или одноцепочечной ДНК, основан на двухступенчатой термодинамической модели. Две комплементарные молекулы ДНК А и В либо связаны друг с другом либо свободны в растворе («random coil state»). Обычно считается, что молекулы А и В полностью комплементарны, поэтому очевидна их гибридизация, а также разрешены одна или несколько ошибок комплементарности в дуплексе, в том числе допустимы и некомплементарные пары G-G, G-T и G-A ( wobble pairs ). В случае же только одной молекулы предполагается упаковка её в петлевую структуру. Процесс гибридизации в дуплекс описывается формулой:

$A+B\longleftrightarrow AB$

где А и В — разные цепи в растворе («random coil state»), и АВ — образованный дуплекс. Данная реакция обратима. Константа равновесия k для этой реакции определяется как: $k={\frac {[AB]}{[A][B]}}$ .

Константа равновесия зависит от концентрации цепей, от температуры, концентрации солей, рН и других компонентов в реакции (например, глицерин или DMSO ). Константа k меняется в ответ на изменение концентрации одной или обоих цепей ([At] и/или [Bt]), тогда вся система отвечает на изменения, и тогда индивидуальные концентрации [A], [B] и [AB] тоже изменятся. Например, если в системе больше цепи А, то концентрация [AB] увеличится. Предположим, константа равновесия равна 1,81×10 ⁶ и концентрация цепей [At] = [Bt] = 10 ⁻⁵ M:

$k=1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$[At]=10^{-5}M=[A]+[AB]$

$[Bt]=10^{-5}M=[B]+[AB]$

Подставляем компоненты в формулы для вычисления k :

$k={\frac {[AB]}{([A]-[AB])([Bt]-[AB])}}$

$k=1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{(10^{-5}-[AB])(10^{-5}-[AB])}}$

После перестановки получаем:

$O=k[AB]^{2}-{\frac {k[At]+k[Bt]+1}{[AB]+k[At][Bt]}}$

$O=aX^{2}+bX+c$

где $[AB]=X={\frac {\pm b{\sqrt {(}}b^{2}-4ac)}{2a}}$ .

Например, при подстановке в эту формулу [AB] = 7,91x10 ⁻⁶ M концентрация цепей составит [A] = [B] = 2,09x10 ⁻⁶ M. То есть только 79 % цепей [At] будет связаны в дуплекс [AB].

Возможно ли определить константы равновесия при изменении температуры? Это подводит нас к пониманию важных термодинамическим параметрам как свободной энергии (dG), энтальпия (dH) и энтропия (dS). Изменения свободной энергии, энтальпия и энтропия происходят при переходе от «температуре Т гибридизации» к беспорядочному, случайному состоянию. Эти отношения определяются формулой dG = dH – TdS , (для концентрации цепей [A] = [B] = [AB] = 1M), тогда идеальная формула для вычисления свободной энергии Гиббса:

$dG_{T}^{0}={\frac {dH^{0}-TdS^{0}}{1000}}$

где T температура в кельвинах, dH° (cal/mol) и dS° (cal/mol K).

Существует полезное соотношение, связывающее изменение свободной энергии Гиббса в ходе химической реакции с её константой равновесия:

$dG_{T}^{0}=-RT\cdot \ln(k)$

где R — универсальная газовая постоянная (1.987cal/mol K).

Комбинируя обе формулы, получаем:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}-R\ln(k)}}$

Температура плавления (T _m ) определяется при равновесии, когда половину цепей связаны друг с другом и другая половина находится в свободном состоянии, то есть k=1:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}-273.15$

Температуру плавления для простой петли рассчитывают как $T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}$ . Для ДНК-дуплекса необходимо учитывать концентрацию каждой цепи (в молях, М). Таким образом, если [A] и [B] — концентрации молекул А и В, то общая концентрация цепей, C равна их сумме, [A] + [B].

Предполагается, что концентрация обоих цепей одинаковая [A] = [B] = C/2. В таком случае

$T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\cdot \ln({\frac {C}{f}})}}$

где f = 4. Для самокомплементарного олигонуклеотида [A ₀ ] = C, и тогда и f = 1. Данная температура плавления определяется только в случае, когда половина молекул связаны друг с другом.

Для самокомплементарного олигонуклеотида k = 1/[At] поэтому:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At])}}-273.15$

Для некомплементарного дуплекса, когда [At] ≥ [Bt], k =1/([At] — [Bt]/2), Tm вычисляют так:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At]-{\frac {[Bt]}{2}})}}-273.15$

где [At] — молярная концентрация преобладающей цепи (как правило, ПЦР-праймера), а [Вt] — молярная концентрация цепи с низкой концентрацией (геномная ДНК).

Вычисление температуры плавления

Приращения ΔG, ΔH и ΔS термодинамических параметров G, H и S рассчитываются на основе модели ближайших соседей (nearest neighbour). Для точного прогнозирования вторичной структуры ДНК при гибридизации с использованием динамических алгоритмов программирования требуется база данных по всем возможным термодинамическим параметрам для каждой комплементарной пары оснований, а также для всех вариантов при несовпадающих нуклеотидов, для свободных концов, шпилек и петель. Термодинамическая формула вычисления короткого олигонуклеотида основывается на термодинамических параметрах — энтропии S и энтальпии H, для каждой из 10 вариантов сочетаний четырёх нуклеотидов (Таблица 1). В Таблице 1 представлены термодинамические параметры для ближайших соседей (NN) для пар нуклеотидов при концентрации 1М NaCl.

Для подсчета Tm (°С) осуществляется суммирование всех значений свободной энергии Гиббса для каждой пары с шагом один нуклеотид:

ΔG _общая = ΔG _{начальное} + ΔG _{симметрия} +∑ΔG + ΔG _{AT
_конец}

5’-CGTTGA-3’	= ΔG _{начальное} + ΔG _{симметрия} +	CG + GT + TT + TG + GA + AT _конец
3’-GCAACT-5’		GC CA AA AC CT

ΔG _{теоретическая} = 1.96 + 0 - 2.17 – 1.44 – 1.44 – 1.00 – 1.45 – 1.30 +0.05

ΔG _{теоретическая} = -5.35 kcal/mol

Аналогично подсчитываются приращения энтропии (ΔH = -43.5 kcal/mol) и энтальпии (ΔS = -122.5):

$T_{m}={\frac {-43.5\cdot 1000}{-122.5+1.9872\ln({\frac {0.0004}{4}})}}-273.15=35.8$

Многие ДНК-дуплексы имеют конкурирующие однонитевые структуры. Это сдвигает равновесие системы, и в результате значение T _m становится меньше предсказанного формулой значения.

Общая формула для вычисления T _m с коррекцией на соль в растворе:

$T_{m}={\frac {\Delta H\cdot 1000}{dS+R\ln({\frac {C}{4}})+0.386(L-1)\ln([K^{+}])}}-273.15$

где L — длина олигонуклеотида, R — газовая постоянная (1.987cal/K mol), c — концентрация олигонуклеотида в (обычно 2x10 ⁻⁷ M), [K ⁺ ] — концентрация ионов калия в молях (обычно 5x10 ⁻² M).

Таблица 1. Термодинамические параметры для ближайших соседей (NN) для пар нуклеотидов при концентрации 1М NaCl ,
Последовательность пар (5'-3'/3'-5')	$\Delta H$ ° kcal/mol	$\Delta S$ ° cal/(mol·K)	$\Delta G$ ° ₃₇ kcal/mol
AA/TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0.88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0.58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT/GA	-7.8	-21.0	-1.28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8.0	-19.9	-1.84
инициация	+0.2	-5.7	+1.96
концевая пара A-T	+2.2	+6.9	+0.05
коррекция на симметрию	0.0	-1.4	+0.43

Одиночная ошибка внутри дуплекса

Модель ближайших соседей для комплементарных нуклеотидных пар может расширен для пары, включающие некомплементарные нуклеотиды. Было показано, что существует тенденция, уменьшающая стабильность некомплементарных пар оснований в порядке убывания:

G-C > A-T > G·G > G·T ≥ G·A > T·T ≥ A·A > T·C ≥ A·C ≥ C·C

Гуанидин G является наиболее «неразборчивым» основанием, поскольку он образует как самые «сильные» пары оснований, так и стабильные пары с некомплементарными основаниями (G·G, G·T и G·A). С другой стороны, цитозин C является наиболее дискриминационным основанием, поскольку он образует самые стабильные комплементарные пары и неустойчивые пары с некомплементарными основаниями (T·C ≥ A·C ≥ C·C) , .

См. также

Примечания

Wallace R. B., Shaffer J., Murphy R. F., Bonner J., Hirose T., Itakura K. (англ.) // (англ.) ( : journal. — 1979. — Vol. 6 , no. 11 . — P. 3543—3557 . — doi : .
Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. (англ.) // Clinical Chemistry : journal. — 2001. — Vol. 47 , no. 11 . — P. 1956—1961 . 1 сентября 2012 года.
SantaLucia J. J., Hicks D. (англ.) // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure : journal. — 2004. — Vol. 33 . — doi : .
SantaLucia J. J. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. — 1998. — Vol. 95 , no. 4 . — P. 1460—1465 . — doi : . — . — PMC .
Peyret N., Seneviratne P. A., Allawi H. T., SantaLucia J. J. (англ.) // Biochemistry : journal. — 1999. — Vol. 38 . — P. 3468—3477 . — doi : .
Allawi H. T., SantaLucia J. J. (англ.) // Biochemistry : journal. — 1997. — No. 36 . — P. 10581—10594 . — doi : .