Иммунопреципита́ция — метод выделения белка из сложных смесей, таких как клеточные лизаты , сыворотки и тканевые гомогенаты , при помощи специфичных к белку антител . Иммунопреципитация позволяет детектировать изменения экспрессии белка, характеризовать белки, с которыми исследуемый белок образует комплекс, выявлять сайты связывания белка с нуклеиновыми кислотами .

Методология

При проведении иммунопреципитации антитела связывают на микрогранулах. Чаще всего используются микрогранулы из агарозы . Также могут быть использованы микрогранулы, обладающие магнитными свойствами. При помощи магнита магнитные микрогранулы, несущие , могут быть удержаны в пробирке во время удаления из неё не связавшихся с антителом компонентов образца .

В зависимости от способа связывания антител на микрогранулах, различают три технологии иммунопреципитации. В классической технологии применяются микрогранулы, покрытые белком A или белком G . Белок A, как и белок G, может связываться с Fc -областью широкого спектра антител. Антитело, специфичное к выделяемому белку, инкубируют со смесью, из которой планируют выделить данный белок. После образования комплекса выделяемого белка ( антигена ) с антителом в смесь вводят микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Комплексы антиген-антитело связываются на микрогранулах. При помощи центрифугирования и промывки, микрогранулы со связанными комплексами антиген-антитело отделяют от смеси. Антиген и антитело элюируют с микрогранул. Иногда в смесь вводят микрогранулы, с которыми были предварительно связаны антитела. Основной недостаток классической технологии заключается в том, что при элюции выделяемого белка с микрочастицы антитело также будет снято с микрочастицы. В результате, выделяемый белок будет загрязнен, и антитела нельзя будет использовать повторно .

Загрязнения выделяемого белка и потери антител можно избежать путём иммобилизации антител на микрочастице. Существует две технологии: иммобилизация за счёт ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G, расположенного на поверхности микрочастицы, и иммобилизация за счёт образования ковалентной связи между антителом и материалом микрочастицы. Эти технологии также имеют свои недостатки. Недостаток ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G заключается в том, что сшивающий реагент может образовывать ковалентные связи в произвольных участках антитела, повреждая активный центр , и, как следствие, антитело теряет способность связывать антиген. Недостаток ковалентной сшивки антитела и материала микрочастицы состоит в том, что, в отличие от технологий с использованием белка A или белка G, произвольный участок антитела свяжется с микрочастицей, что может привести к потере способности антитела связывать антиген .

В ситуации, когда антитела к выделяемому белку недоступны, к нему, с использованием генно-инженерных методов, может быть пришит тег (например, ), к которому антитела доступны .

К достоинствам иммунопреципитации стоит отнести то, что в этом методе антигены взаимодействуют с антителами в их для дальнейшего разделения и количественного анализа. Более того, метод иммунопреципитации позволяет концентрировать белок. Недостаток метода состоит в том, что для эффективного обнаружения белок должен быть радиоактивно мечен .

Разновидности иммунопреципитации

Ко-иммунопреципитация

Ко-иммунопреципитация (Co-IP) — это иммунопреципитация целого белкового комплекса , которая основана на использовании антитела, специфичного к одному из белков, входящих в состав комплекса. Связывая этот белок, антитело связывает весь комплекс. В результате появляется возможность идентифицировать все белки, входящие в состав комплекса .

Иммунопреципитация хроматина

(ChIP) — метод нахождения сайтов связывания исследуемого в геноме . Для этого ДНК выделяют из клетки и режут на небольшие фрагменты, а затем проводят иммунопреципитацию, используя антитела к исследуемому ДНК-связывающему белку. В результате с антителами связываются комплексы, состоящие из исследуемого ДНК-связывающего белка и фрагмента ДНК . Такие фрагменты ДНК и есть сайты связывания исследуемого ДНК-связывающего белка в геноме. Для чтения нуклеотидной последовательности данных фрагментов ДНК используют ДНК-микрочипы (ChIP-on-chip) или современные методы секвенирования (ChIP-seq) .

Иммунопреципитация РНК

Иммунопреципитация РНК (RIP) — метод, позволяющий идентифицировать молекулы РНК, взаимодействующие с исследуемым РНК-связывающим белком, и определять сайты связывания исследуемого белка с молекулами РНК. Процедура иммунопреципитации РНК аналогична иммунопреципитации хроматина . Для чтения нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов РНК используют ДНК-микрочипы, предварительно получив комплементарные выделенным фрагментам молекулы ДНК (RIP-chip), или современные методы секвенирования (RIP-seq) .

Примечания

Литература

• Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. Молекулярная биология клетки / Перевод с английского А. Н. Дьяконовой, А. В. Дюбы и А. А. Светлова. Под ред. Е. С. Шилова, Б. П. Копнина, М. А. Лагарьковой, Д. В. Купраша.. — М.—Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2013. — Т. 1. — С. 663—665. — 1052 с. — ISBN 978-5-4344-0137-1 .

Ссылки

• (неопр.) .
• (неопр.) .