Авидин представляет собой биотин -связывающий белок, вырабатываемый в яйцеводах птиц , рептилий и амфибий и откладывающийся в белке их яиц . Димерные члены семейства авидинов также обнаружены в некоторых бактериях . В белке куриного яйца авидин составляет примерно 0,05 % от общего белка (примерно 1800 г). мкг на яйцо). Тетрамерный белок содержит четыре идентичные субъединицы (гомотетрамеры), каждая из которых может связываться с биотином (витамин В ₇ , витамин Н) с высокой степенью аффинности и специфичности. Измеренная константа диссоциации авидин-биотинового комплекса составляет K _D ≈ 10 ^-15 M, что делает его одной из самых прочных известных нековалентных связей .

Размер тетрамерной формы авидина оценивается в 66-69 кДа . 10 % молекулярной массы составляют углеводы, состоящие из четырёх-пяти остатков маннозы и трех остатков N-ацетилглюкозамина . Углеводные фрагменты авидина содержат как минимум три уникальных структурных типа олигосахаридов , сходных по структуре и составу .

Функциональный авидин содержится только в сыром яйце, так как биотиновое сродство белка разрушается при варке. Естественная функция авидина в яйцах неизвестна, хотя постулируется, что он вырабатывается в яйцеводе в качестве ингибитора роста бактерий путем связывания биотина, полезного для роста бактерий. В качестве доказательства этого можно привести стрептавидин, родственный белок с таким же сродством к биотину и очень похожим сайтом связывания, который вырабатывается некоторыми штаммами бактерий Streptomyces и, как считается, служит для подавления роста конкурирующих бактерий наподобие антибиотика .

Из коммерчески доступного продукта была выделена негликозилированная форма авидина; однако неясно, встречается ли негликозилированная форма в природе или является продуктом производственного процесса .

Открытие

Авидин был открыт Эсмондом (1914—2003). Это открытие началось с наблюдения, что у цыплят на диете из сырого яичного белка наблюдается дефицит биотина , несмотря на наличие витамина в их рационе . Был сделан вывод, что компонент яичного белка связывал биотин , что Снелл подтвердил in vitro с помощью анализа на дрожжах . Позже Снелл выделил компонент яичного белка, ответственный за связывание биотина, и в сотрудничестве с подтвердил, что изолированный яичный белок был причиной дефицита биотина или «повреждения яичного белка». В то время исследователи из Техасского университета предварительно назвали этот белок авидальбумином (буквально «голодный альбумин») . Позже название белка было изменено на «авидин» из-за его сродства к биотину (авидин + биотин) .

Приложения

Исследования 1970-х годов помогли сделать систему авидин-биотин мощным инструментом биологических наук. Зная о силе и специфичности авидин-биотинового комплекса, исследователи начали использовать куриный авидин и стрептавидин в качестве зондов и матриц сродства в многочисленных исследовательских проектах . Вскоре после этого исследователи Байер и Вилчек разработали новые методы и реагенты для биотинилирования антител и других биомолекул , что позволило использовать систему авидин-биотин в ряде биотехнологических приложений. Сегодня авидин используется в самых разных областях, от исследований и диагностики до медицинских устройств и фармацевтики.

Сродство авидина к биотину используется в широком спектре биохимических анализов, включая вестерн-блоттинг , ELISA , ELISPOT и нисходящие анализы. В некоторых случаях использование биотинилированных антител позволило заменить меченные радиоактивным йодом антитела в системах радиоиммунного анализа , чтобы получить нерадиоактивную систему анализа.

Авидин, иммобилизованный на твердых носителях, также используется в качестве очищающей среды для захвата белка или молекул нуклеиновой кислоты. Например, белки клеточной поверхности могут быть специфически помечены биотиновым реагентом, непроницаемым для мембран, а затем специфически захвачены с использованием носителя на основе авидина.

Модифицированные формы

В качестве основного заряженного гликопротеина авидин проявляет неспецифическое связывание в некоторых применениях. , дегликозилированный авидин с модифицированными аргининами, имеет более нейтральную изоэлектрическую точку (pI) и доступен в качестве альтернативы нативному авидину, когда возникают проблемы неспецифического связывания. Дегликозилированные нейтральные формы куриного авидина доступны через Sigma-Aldrich (Extravidin), Thermo Scientific (NeutrAvidin), Invitrogen (NeutrAvidin) и e-Proteins (NeutraLite).

Учитывая прочность авидин-биотиновой связи, диссоциация авидин-биотинового комплекса требует экстремальных условий, вызывающих денатурацию белка. Необратимый характер авидин-биотинового комплекса может ограничивать применение авидина в аффинной хроматографии, где желательно высвобождение захваченного лиганда. Исследователи создали авидин с обратимыми характеристиками связывания за счет нитрования или йодирования тирозина в сайте связывания . Модифицированный авидин проявляет сильные характеристики связывания биотина при рН 4 и высвобождает биотин при рН 10 или выше . Мономерная форма авидина с пониженным сродством к биотину также используется во многих коммерчески доступных аффинных смолах. Мономерный авидин создается обработкой иммобилизованного нативного авидина мочевиной или гуанидином HCl (6-8 М), придающей ему более низкую диссоциацию K _D ≈ 10 ^-7 М . Это позволяет элюировать из матрицы авидина в более мягких, неденатурирующих условиях, с использованием низких концентраций биотина или условий с низким pH. Для одного сайта связывания биотина с высокой аффинностью без сшивки можно использовать моновалентную версию дальнего родственника авидина, стрептавидина .

Блокирование связывания биотина

Термическая стабильность и биотинсвязывающая активность авидина представляют как практический, так и теоретический интерес для исследователей, поскольку стабильность авидина необычно высока, а авидин является антинутриентом в пище человека . Исследование 1966 года, опубликованное в журнале Biochemical and Biophysical Research Communications , показало, что структура авидина остается стабильной при температуре ниже 70 °C (158 °F) °С. . Выше 70 °C (158 °F) , структура авидина быстро разрушается и к 85 °C (185 °F) обнаруживается обширная потеря структуры и потеря способности связывать биотин . Анализ, проведенный в 1991 году для Journal of Food Science, выявил существенную активность авидина в варёном яичном белке: "средняя остаточная активность авидина в жареном, варёном и варёном (2 минуты) яичном белке составляла 33, 71 и 40 % активности в сыром яичном белке. " Анализ показал, что времени приготовления было недостаточно для адекватного нагревания всех холодных участков в яичном белке. Полная инактивация биотинсвязывающей способности авидина требует кипячения более 4 минут .

Исследование 1992 года показало, что термическая инактивация биотинсвязывающей активности авидина была описана D ₁₂₁ . _°C = 25 мин и z = 33 °С. Это исследование противоречило предыдущим предположениям, «что сайт связывания авидина разрушается при тепловой денатурации » .

Биотин-связывающие свойства авидина были использованы при разработке , низкомолекулярного гепарина длительного действия, используемого для лечения . Из-за пролонгированного действия идрапаринукса были высказаны опасения по поводу клинического лечения геморрагических осложнений. При добавлении фрагмента биотина к молекуле идрапаринукса образуется идрабиотапаринукс; его антикоагулянтную активность в условиях кровотечения можно отменить путем внутривенного вливания авидина .

См. также

• Стрептавидин

Использованная литература

Ссылки

• — статья о структуре в Protein Data Bank