Vault , или цитоплазмати́ческий рибонуклеопротеи́н vault (с англ. — «свод»), — эукариотическая органелла , химически представляет собой рибонуклеопротеин . Под электронным микроскопом эти органеллы напоминают свод купола собора с осью симметрии 39-го порядка . Функции vault плохо изучены, однако к настоящему времени имеются свидетельства об участии их в различных сигнальных путях клетки . Возможно, vault вовлечены в развитие явления множественной лекарственной устойчивости к противораковой химиотерапии . Они имеются во многих типах эукариотических клеток и высококонсервативны среди эукариот .

История изучения

Vault были открыты и успешно выделены из печени крысы в 1986 году клеточным биологом Нэнси Кедерша ( англ. Nancy Kedersha ) и биохимиком ( англ. Leonard Rome ) из Школы Медицины Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе . Первоначально vault были описаны как яйцевидные частицы, загрязнявшие препараты окаймлённых клатрином везикул . Частицы были выделены с помощью центрифугирования в сахарозы и электрофореза в агарозном геле. Оказалось, что они имеют симметричную бочонковидную структуру, похожую на свод готического собора, за что частицы и получили своё название (от англ. vault — свод). Первоначально размер vault был оценен в 35 × 35 × 65 нм ³, но позднее с использованием методов криоэлектронной микроскопии он был уточнён до 41 × 41 × 72,5 нм³. Таким образом, vault являются самыми крупными из когда-либо описанных цитозольных неикосаэдрических нуклеопротеинов. Далее структура vault изучалась с помощью рентегноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса . В 2009 году структура vault из печени крысы была определена с разрешением 3,5 Å .

Структура vault

Vault — самые крупные рибонуклеопротеиновые частицы. По размерам они примерно в 3 раза превосходят рибосому и весят около 13 МДа . Vault состоят по большей части из белков , в связи с чем их трудно окрашивать стандартными методами. Белковая составляющая vault представлена множеством молекул (MVP) (95,8 кДа), на долю которого приходится более 70 % всего белка в частице , а также белками VPARP (∼192 кДа) и (∼291 кДа). Кроме того, в состав vault входят vault РНК ( ) длиной 86—141 нуклеотидов . Общая масса РНК в vault оценивается в ∼460 кДа .

Частица vault достигает около 670 Å в длину и имеет наибольший диаметр ∼400 Å. Стенка имеет толщину лишь в 15–25 Å; внутри неё находится полость длиной около 620 Å и максимальным диаметром ∼350 Å. Частица состоит из двух симметричных половин, каждая из которых состоит из трёх частей: тела, плечевого участка и шапочки. Тело содержит 78 копий 9 повторяющихся структурных доменов MVP (39 копий в каждой половине), сужающаяся часть сформирована связанными конец к концу структурными повторяющимися доменами R1. Высота плечевого участка составляет ∼25 Å, а диаметр ∼315 Å. Шапочки имеются на обоих концах частицы, и каждая из них содержит 39 копий домена шапочка-спираль ( аминокислотные остатки MVP с Asp647 пр Leu802) и домена шапочка-кольцо (с Gly803 по Ala845). Высота шапочки составляет ∼155 Å, а внутренний и внешний диаметры домена шапочка-кольцо достигают ∼50 Å и ∼130 Å соответственно .

MVP содержит 9 повторяющихся структурных доменов (R1—R9). Домены R8 и R9 состоят из пяти антипараллельных β-листов, обозначаемых S1, S2, S3, S4 и S5. В оставшихся семи доменах имеется два дополнительных (S2a и S2b), вставленных между S2 и S3. По некоторым данным, R1, как и R8 и R9, состоит из пяти антипараллельных β-листа, в то время как у R2 имеется два более длинных антипараллельных листа между S2 и S3. Каждый домен имеет . Анализ аминокислотных последовательностей показал, что в R3 и R4, возможно, имеются два домена типа . Дальнейшее изучение показало, что MVP взаимодействует с другими белками , такими как PTEN, через предполагаемые два домена EF hand при участии ионов Ca ²⁺ , впрочем, с этим согласуются не все экспериментальные данные .

Плечевой участок (с Pro520 по Val646) сворачивается в один α/β- глобулярный домен с 4 антипараллельными бета-листами на одной стороне и четырьмя α-спиралями на другой. По-видимому, именно в плечевом участке находятся элементы, отвечающие за взаимодействие vault с липидными рафтами .

Домен шапочка-спираль сворачивается в α-спираль из 42 витков, которая укладывается в суперспираль. Домен шапочка-кольцо расположен на конце шапочки и формирует U-образную структуру со спиральными элементами на обоих концах .

vРНК располагаются в шапочках на концах частиц vault. Белок TEP1, по-видимому, располагается в верху плоской части шапочки, где его участок формирует структуру типа кольцевой . N-концевая часть TEP1 содержит 4 повторяющихся домена неясного функционального назначения, РНК -связывающий домен и ATP / GTP -связывающий домен. Было показано, что TEP1 взаимодействует с и различными человеческими vРНК. VPARP располагаются в основном в шапочке vault .

В следующей таблице обобщены основные сведения о компонентах vault .

Компонент	Характеристика	Локус	Положение и взаимодействия в vault	Функции
MVP	96 копий белка составляют основную массу vault. Способны самособираться в vault. Не имеют функций вне vault	16p11.2	Тело и шапочка vault, нет необходимых партнёров	Структурная; управляют связыванием с сигнальными белками
VPARP	Слабая поли(ADP-рибоза)-полимераза, лишь частично связана с vault	13q11	Шапочка, непосредственно связываются с N-концевой частью MVP	Каталитическая : поли(ADP)-рибозилирование MVP
TEP1	Связывается с теломеразой и vault; не необходим для теломеразы	14q11.2	Шапочка, непосредственное связывание с MVP	Каталитическая: сборка vРНК-мишеней в vault
vРНК	hgv1—3, hgv4 не экспрессируется; лишь частично связаны с vault	5q33.11 Xp11.22	Шапочка, связываются с TEP1	Неструктурная, функции плохо изучены

Функции

Широкое распространение vault и их эволюционная консервативность говорят в пользу наличия у этих органелл важных биологических функций, хотя о них известно очень мало. Ничего не известно об изначальных функциях vault в клетках протистов. Тем не менее, имеется несколько предположений относительно роли vault в клетках млекопитающих . В частности, отмечено, что vault особенно много в тканях и клетках, связанных с очисткой организма, например, макрофагах .

Была высказана гипотеза, что vault служат главными «пробками» в ядерных поровых комплексах . Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител против vault показал, что в изолированных ядрах клеток печени крысы vault располагались на поверхности ядерной мембраны . Иммуноэлектронная микроскопия с использованием , конъюгированных с золотом , показала, что в изолированных ядрах vault ассоциированы с ядерными поровыми комплексами. Поэтому, возможно, vault могут принимать участие в нуклеоцитоплазматическом транспорте .

В 2005 году было высказано предположение, что человеческие vРНК hvg1 и hvg2 могут связываться с противораковым препаратом митоксантроном , а также играть важную роль в экспорте токсичных соединений. Впрочем, другое исследование показало, что нарушение работы гена MVP у мышей не приводило к повышению чувствительности к цитостатическим препаратам. Более того, мыши дикого типа и мыши, дефектные по MVP, демонстрировали одинаковый ответ на доксорубицин . В ходе ещё одного исследования было показано, что нокдаун MVP при помощи малых интерферирующих РНК не влиял на удаление доксорубицина из ядра. Кроме того, повышение экспрессии MVP у хемочувствительных клеток не повышало устойчивости к препаратам. Эти результаты говорят в пользу того, что MVP и vault не вносят непосредственный вклад в устойчивость к цитостатическим агентам .

Ряд недавних исследований показал участие vault в различных сигнальных путях клетки, и количество таких путей постоянно растёт. На дрожжевой двугибридной системе было показано, что MVP может связываться с PTEN — белком-супрессором опухолей , который , отрицательно регулируя сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназы / протеинкиназы В . N-концевой фосфоинозитид-связывающий мотив и домен С2 PTEN могут взаимодействовать с MVP. MVP является субстратом для , содержащей домен ^* (Src homology 2), и служит в сигнальном пути эпидермального фактора роста (EGF). Оказалось, что SH2-домены SHP-2 связывались с MVP, фосфорилированным по остаткам тирозина , и это связывание усиливалось под действием EGF. Таким образом, MVP функционирует как белок скэффолда для SHP-2 и киназ , регулируемых внеклеточно, и регуляция фосфорилирования MVP через SHP-2 может иметь важное значение для выживания клетки. Кроме того, было показано взаимодействие между MVP и доменом SH2 Src в клетках желудка человека и клетках рака желудка 253J. Иммунопреципитация и иммунофлуоресцентный анализ показали, что EGF усиливал взаимодействие между MVP и Src, и оно блокировалось под действием ингибитора Src . EGF также стимулирует перемещение MVP из ядра в цитозоль и околоядерную зону цитоплазмы , где MVP колокализуется с Src. Предполагается роль MVP как нового регулятора Src-опосредованных сигнальных каскадов. Было установлено, что MVP является белком, индуцируемым интерфероном γ (IFN-γ): в ответ на IFN-γ наблюдалось значительное повышение уровня мРНК и самого белка MVP. Эта активация вовлечена во взаимодействие STAT1 и сайта, активируемого IFN-γ, в проксимальном промоторе MVP. Кроме того, IFN-γ значительно повышал темпы трансляции MVP. Показано, что vault могут взаимодействовать с эстрогеновыми рецепторами при связывании с эстрадиолом и вместе с рецепторами переносятся в ядро . Согласно последним данным, vault и MVP могут взаимодействовать с инсулиноподобным фактором роста 1 , HIF1A , а также затрагивать два главных процесса репарации двуцепочечных разрывов в ДНК : негомологичное соединение концов и гомологичную рекомбинацию . Таким образом, частицы vault функционируют как центральные платформы взаимодействия в клеточных сигнальных каскадах .

VRARP, другой белок, входящий в состав vault, является поли(ADP-рибоза)-полимеразой .

Необычная структура и своеобразная динамика vault, а также их крупный размер наводят на мысль, что, возможно, vault функционируют как природные наноконтейнеры для ксенобиотиков , нуклеиновых кислот и белков. Ведутся работы по разработке рекомбинантных vault, в частности, по обеспечению взаимодействия vault с поверхностными клеточными рецепторами и заключению в них разнообразных грузов .

В следующей таблице обобщены основные сведения о белках, с которыми взаимодействуют vault .

Белок	Характеристика	Локус	Взаимодействие с vault	Функции, связанные с vault
PTEN	Белок-супрессор опухолей, главная ингибиторная фосфатаза пути PI3K. Главный субстрат PIP3	10q23.3	MVP (N-конец), Ca 2+ -зависимое взаимодействие	Усиление ядерных функций PTEN
SHP-2	Протеинтирозинфосфатаза; активатор роста, опосредованного рецепторными тирозинкиназами (RTK)	3q13.13	MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие)	Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK -активности
	Митоген -активируемая тирозинкиназа ; главный передатчик RTK-опосредованных сигналов пролиферации	22q11.22	MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие)	Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
Src	(Прото) онкоген , тирозинкиназа	20q11.2	MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие)	Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
	E3 убиквитинлигаза , у позвоночных разрушает и p53	1q25.1—1q25.2	MVP (фосфорилирование MVP, уменьшающееся от УФ-излучения )	Подавляет EGF-опосредованную активацию MAPK
Эстрогеновый рецептор	гормона эстрадиола, индуцирует лиганд -зависимую транскрипцию генов-мишеней	6q25.1	MVP (гормонзависимое взаимодействие)	Ядерный импорт и активация эстрогенового рецептора
La	Связывает и защищает 3'-концевые элементы UUU(OH) транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой III	2q31.1	vРНК	Защита vРНК

Клиническое значение

Рак

В 1990-х годах появились сообщения о том, что vault могут быть непосредственно вовлечены в развитие множественной лекарственной устойчивости в раковых клетках. Оказалось, что белок, связанный с множественной устойчивостью и известный под названием LRP ( англ. Lung Resistance-related Protein — белок, связанный с множественной устойчивостью в лёгких ) на самом деле является человеческим MVP. В ходе другого исследования связь между vault и множественной лекарственной устойчивостью была показана на клетках человеческого рака толстой кишки SW-620. Обработка SW-620 увеличивала экспрессию MVP и приводила к устойчивости к доксорубицину, винкристину , грамицидину D и паклитакселу . Трансфекция клеток рибозимами , специфичными к MVP, подавляла эти активности .

Свой вклад в развитие множественной лекарственной устойчивости могут вносить и vРНК. В 2009 году было установлено, что некодирующие vРНК могут процессироваться в малые vРНК (svРНК) при участии Dicer , которые далее функционируют путём РНК-интерференции подобно микроРНК : svРНК связываются с белком семейства Argonaute и отрицательно регулируют экспрессию CYP3A4 — фермента , участвующего в .

В последние годы накапливаются свидетельства того, что vault связаны с функционированием систем репарации ДНК в клетке, поэтому, возможно, они вносят свой вклад в нечувствительность к не только химиотерапии , но и радиотерапии рака .

Инфекционные заболевания

В 2007 году две исследовательские группы сообщили об участии vault в ответе на инфекции . Оказалось, что в человеческих B-клетках , заражённых вирусом Эпштейна — Барр , наблюдались повышенные уровни vРНК, которые, возможно, участвуют в защите от вируса и/или транспортных механизмах. Кроме того, было показано, что при заражении эпителиальных клеток лёгких человека бактерией Pseudomonas aeruginosa MVP быстро рекрутировался в липидные рафты , где участвует в механизмах усиления врождённого иммунного ответа . Мыши MVP ^−/− имели в 3,5 раза больше бактерий на грамм лёгочной ткани, чем мыши дикого типа, и чаще умирали от инфекции, вызванной P. aeruginosa .

Эволюционная консервативность

Vault были описаны у млекопитающих , земноводных , птиц , а также слизевика Dictyostelium discoideum . Согласно информации из базы данных Pfam , гомологи белков, входящих в состав vault, выявлены у инфузории , кинетопластид , многих позвоночных , актинии Nematostella vectensis , моллюсков , Trichoplax adhaerens , плоских червей (в частности, Echinococcus granulosus ) и хоанофлагеллят .

У ряда эукариотических организмов не было обнаружено гомологов белков vault. Среди них такие модельные организмы , как растение Arabidopsis thaliana , нематода Caenorhabditis elegans , плодовая мушка Drosophila melanogaster и пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae . Однако, несмотря на эти исключения, высокая степень сходства vault у различных организмов говорит о том, что эти органеллы имеют некоторое эволюционное значение . Согласно последним данным, последний общий предок эукариот имел vault, однако впоследствии они были утрачены у ряда групп, в том числе грибов , насекомых и, возможно, растений .

Примечания

Литература

• Rome L. H. , Kickhoefer V. A. (англ.) // ACS nano. — 2013. — Vol. 7, no. 2 . — P. 889—902. — doi : . — . [ ]
• Reis E. V. , Pereira R. V. , Gomes M. , Jannotti-Passos L. K. , Baba E. H. , Coelho P. M. , Mattos A. C. , Couto F. F. , Castro-Borges W. , Guerra-Sá R. (англ.) // Parasitology international. — 2014. — Vol. 63, no. 1 . — P. 120—126. — doi : . — . [ ]
• Casañas A. , Querol-Audí J. , Guerra P. , Pous J. , Tanaka H. , Tsukihara T. , Verdaguer N. , Fita I. (англ.) // Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. — 2013. — Vol. 69, no. Pt 6 . — P. 1054—1061. — doi : . — . [ ]

Ссылки

• (неопр.) .
• MeSH