Структу́ра Холлиде́я ( англ. Holliday junction ) — структура из четырёх цепей нуклеиновых кислот , соединённых друг с другом водородными связями с образованием четырёх двуцепочечных ветвей. Эти ветви могут принимать несколько различных конформаций в зависимости от концентрации солей в окружающем буферном растворе и последовательности нуклеотидов , располагающихся в непосредственной близости от точки соединения. Структура названа в честь английского молекулярного биолога , который предположил её существование в 1964 году.

В живых клетках структуры Холлидея являются важными промежуточными соединениями, возникающими при процессах генетической рекомбинации и репарации двуцепочечных разрывов. Как правило, эти структуры имеют симметричные последовательности нуклеотидов и потому обладают некоторой мобильностью, то есть отдельные двуцепочечные ветви могут скользить с сохранением структуры соединения и паттерна спаривания азотистых оснований . Структуры из четырёх цепей, похожие на структуры Холлидея, также обнаруживаются в некоторых молекулах РНК .

Неподвижные структуры Холлидея с несимметричными последовательностями, которые фиксируют структуру в строго определённом положении, были созданы искусственно с целью изучения их структуры как модели природных структур Холлидея. Позднее такие структуры нашли применение в качестве основных строительных структурных блоков в ДНК-нанотехнологиях : несколько структур Холлидея могут быть собраны в единую конструкцию с определённой геометрией, образуя молекулы с высокой степенью структурной жёсткости.

Структура

Стэкинг в структурах Холлидея

Структура Холлидея со стэкингом, объединяющим четыре цепи в два двуцепочечных домена. Синяя и красная цепи сохраняют почти спиральную структуру, а жёлтая и зелёная переходят из одного двуцепочечного домена в другой

Структура Холлидея без стэкинга

Структуры Холлидея могут существовать в виде различных конформационных изомеров (конформеров), различающихся способами между четырьмя двуцепочечными ветвями. Коаксиальный стэкинг заключается в склонности тупых концов в структурах нуклеиновых кислот к связыванию друг с другом посредством связывания выставленных наружу азотистых оснований. Существуют три различных конформера, различающихся стэкингом : форма, лишённая коаксиального стэкинга, и две формы с коаксиальным стэкингом. Форма без стэкинга преобладает в отсутствие катионов двухвалентных металлов , например, Mg ²⁺ , в силу электростатического отталкивания отрицательно заряженных остовов цепей. В присутствии уже хотя бы 0,1 мМ Mg ²⁺ электростатическое отталкивание нейтрализуется, и преобладают структуры со стэкингом .

Формы, лишённые стэкинга, имеют почти плоскую квадратную структуру. Конформеры со стэкингом состоят из двух двуцепочечных доменов, расположенных под углом 60° по правилу правой руки . Две из четырёх цепей (по одной из каждого домена) сохраняют спиральную структуру, а две другие переходят из одного домена в другой образом .

Два возможных конформера со стэкингом различаются тем, в каких именно цепях происходит стэкинг. Преобладание одной из форм в значительной мере определяется конкретной последовательностью нуклеотидов вблизи точки соединения. Некоторые из этих последовательностей таковы, что два конформера находятся в равновесии друг с другом, в то время как другие последовательности определяют выраженное преобладание одного из конформеров. Так, в соединениях Холлидея, у которых в точке соединения четырёх цепей находится последовательность A-CC, значительно преобладает тот конформер, который позволяет образовываться водородным связям между вторым цитозином и одним из фосфатов в точке соединения .

В соединениях Холлидея с симметричными последовательностями точка соединения четырёх цепей (точка ветвления) может перемещаться по модели случайного блуждания . Скорость перемещения точки ветвления значительно варьирует в зависимости от концентрации ионов : если в отсутствие ионов продолжительность одного акта смещения составляла 0,3−0,4 мс, то в присутствии 10 мМ Mg ²⁺ она составляла 270−300 мс. Изменение скорости связано с образованием структур со стэкингом вместо структур без стэкинга .

Если в соединении Холлидея происходит одноцепочечный разрыв, то точка соединения принимает перпендикулярную ориентацию и образуется форма со стэкингом (см. рис.) .

Соединения Холлидея из РНК принимают антипараллельную конформацию со стэкингом при высоких концентрациях магния, перпендикулярную конформацию со стэкингом при средних концентрациях и параллельную конформацию со стэкингом при низких концентрациях; однако даже при малых концентрациях кальция они принимают антипараллельную структуру .

Биологические функции

Соединение Холлидея является ключевым интермедиатом , образующимся при гомологичной рекомбинации , а также при , в которой принимают участие интегразы . Кроме того, оно образуется при репарации двуцепочечных разрывов. Наконец, крестообразные структуры, включающие соединения Холлидея, могут образовываться с целью ослабления спирального напряжения в симметричных последовательностях в суперспиралях ДНК . Четырёхцепочечные структуры, встречающиеся в некодирующих РНК , например, в и содержащем шпильку рибозиме , обычно содержат неспаренные нуклеотиды между двуцепочечными участками и потому, строго говоря, не являются соединениями Холлидея .

В ходе гомологичной рекомбинации соединения Холлидея образуются между идентичными или почти идентичными последовательностями, в результате чего цепи располагаются симметрично относительно центральной точки ветвления. Это позволяет происходить процессу , при котором цепи перемещаются через точку соединения . Разрезание, или разрешение структуры Холлидея может осуществляться двумя путями, один из которых приводит к кроссинговеру , при котором образуются две рекомбинантные цепи, а другой — к конверсии генов , в результате которой образуется только одна рекомбинантная цепь .

Многие белки могут распознавать и искажать структуру соединения Холлидея. Таковы, например, , иногда зависимым от последовательностей образом. Эти белки по-разному нарушают структуру соединения Холлидея, часто переводя соединение Холлидея в конформацию без стэкинга, разрушая центральные пары оснований и/или изменяя углы между четырьмя цепями. Другие белки, распознающие соединения Холлидея — белки точки ветвления, которые усиливают темпы рекомбинации на порядок, а также сайт-специфичные рекомбиназы . У прокариот ферменты, разрешающие соединения Холлидея (резольвазы), делятся на два семейства — интегразы и нуклеазы . Эти белки структурно схожи, несмотря на отсутствие консервативности в последовательностях .

У эукариот репарация двуцепочечных разрывов посредством гомологичной рекомбинации может осуществляться двумя различными путями: путём репарации двуцепочечных разрывов (DSBR), часто также называемым моделью двойного соединения Холлидея, и путём синтезозависимого выпрямления цепей (SDSA) . При двуцепочечном разрыве 3'-конец одной из цепей разрушается, а более длинный 5'-конец подходит к одной из сестринских хроматид другой хромосомы и связывается с ней; в результате образуется репликационный «пузырь». Когда «пузырь» подходит к месту разрыва ДНК , более длинный 5'-конец антисмысловой цепи вновь связывается со смысловой цепью. Далее происходит синтез недостающих участков ДНК с использованием в качестве матриц сестринской хроматиды из другой гомологичной хромосомы. Когда в конце заполнения брешей разъединённые концы сестринских хроматид соединяются друг с другом, образуются две структуры Холлидея, которые потом разрешаются при помощи разнообразных белков .

У бактерий двуцепочечные разрывы в ДНК репарируются белком RecBCD по механизму гомологичной рекомбинации. Репарация одноцепочечных разрывов происходит по варианту гомологичной рекомбинации, известному как . В ходе этих двух путей (RecBCD и RecF) происходят такие процессы, как миграция ветвей, при которой происходит обмен одноцепочечными фрагментами ДНК между двумя перекрещенными молекулами ДНК, и разрешение, при котором перекрещенные молекулы ДНК отделяются друг от друга и возвращаются в своё нормальное двуцепочечное состояние . У бактерий миграция ветвей облегчается комплексом и белком RecG — белковыми молекулярными моторами, которые используют энергию гидролиза АТР для перемещения соединения. После этого соединения Холлидея должно разрешиться на два раздельных дуплекса ДНК, возвращая исходное или рекомбинированное состояние. В миграции цепей участвуют белки RuvA и RuvB, в то время как RuvC разрешает соединение Холлидея .

Гомологичная рекомбинация описана у нескольких групп вирусов . У ДНК-содержащих вирусов (например, герпесвирусов ) рекомбинация осуществляется по пути разрыва-воссоединения — подобно тому, как это происходит у бактерий и эукариот . Имеются доказательства существования рекомбинации у РНК-содержащих вирусов , особенно у вирусов, содержащих одноцепочечную РНК положительной — таких, как ретровирусы , коронавирусы и пикорнавирусы ; ситуация с вирусами, содержащими РНК отрицательной полярности (например, с вирусом гриппа ), более спорная .

Разрешение соединений Холлидея

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae разрешение структур Холлидея может происходить четырьмя различными путями . Путь, наиболее часто приводящий к кроссинговеру у дрожжей и, возможно, млекопитающих , включает белки , гетеродимер — (известный как MutL гамма) и ( ортолог ) . MLH1—MLH3 связывается преимущественно с соединениями Холлидея . Он является эндонуклеазой , которая вносит одноцепочечные разрывы в сверхспирализованную двуцепочечную ДНК и способствует кроссинговеру . В то время как три других пути, в которые вовлечены белки —MMS4, и YEN1 соответственно, могут способствовать разрешению соединений Холлидея in vivo , отсутствие этих трёх нуклеаз лишь незначительно снижает частоту кроссинговера. Двойные мутанты , лишённые и MLH3, и MMS4, демонстрировали значительное снижение частоты кроссинговера по сравнению с диким типом ; впрочем, разъединение хромосом в большинстве случаев происходило без ошибок, и жизнеспособность спор дрожжей была довольно высокой (62 %) .

Хотя белок MUS81 является компонентом малого пути кроссинговера при мейозе у почкующихся дрожжей, растений и позвоночных , у инфузории Tetrahymena thermophila он задействован в необходимом, но не доминирующем пути кроссинговера. У делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe путь с участием MUS81 является доминирующим механизмом кроссинговера .

Белки MSH4 и MSH5 образуют гетеродимер у человека и дрожжей . У дрожжей он облегчает кроссинговер между гомологичными хромосомами при мейозе . Комплекс / связывает и стабилизирует двойные соединения Холлидея, способствуя их разрешению с образованием рекомбинантных цепей. У мутантов S. cerevisiae с частично функциональным MSH4 количество кроссинговеров на геном снижено на 30 %, и во многих случаях мейоз не сопровождается рекомбинацией. Тем не менее, споры этого мутанта жизнеспособны, поэтому разделение гомологичных хромосом происходит правильно. Таким образом, у S. cerevisiae разделение хромосом при мейозе не целиком зависит от кроссинговера .

Использование в ДНК-нанотехнологиях

ДНК-нанотехнологии занимаются разработкой и производством искусственных нуклеиновых кислот, которые не несут генетической информации , как в живых клетках, а выступают в роли материалов для нанотехнологий . Разветвлённые структуры ДНК используются в качестве элементарных единиц для создания более сложных спроектированных структур. В состав многих таких структур ДНК входят соединения Холлидея. Одиночные соединения Холлидея слишком гибки для того, чтобы быть способными к сборке в длинные упорядоченные ряды, поэтому в качестве жёстких единиц для сборки крупных единиц используются , содержащие несколько соединений Холлидея .

Из таких мотивов наиболее часто используется комплекс двойного кроссинговера (DX), который содержит два соединения Холлидея, расположенных близко друг к другу, в результате чего образуется жёсткая структура, которая может самостоятельно собираться в ряды более высокого порядка. В молекуле DX соединения Холлидея ориентированы так, что их двуцепочечные участки располагаются бок о бок, а не под более предпочтительным углом 60°. Комплекс можно спроектировать таким образом, чтобы соединения располагались в параллельной или антипараллельной ориентации, однако на практике антипараллельная ориентация более удобна, и параллельная используется редко .

Структурный мотив DX является элементарным строительным блоком в методе , который используется для создания более крупных дву- и трёхмерных структур произвольной формы. Сборка длинных протяжённых «лент» осуществляется не из отдельных единиц DX, а из двуцепочечных нитей ДНК; эти нити укладываются в правильную форму при помощи вспомогательных цепей, которые образуют соединения Холлидея как цепи, участвующие в кроссиновере .

Некоторые строительные единицы, используемые в ДНК-нанотехнологиях, сохраняют присущий соединениям Холлидея угол 60°. Например, в таких единицах 4 соединения Холлидея могут образовывать параллелограмм . Эта структура интересна тем, что она позволяет непосредственно визуализировать угол в соединении при помощи атомно-силовой микроскопии . Блоки из трёх соединений Холлидея, собранных в треугольник , использовались для создания трёхмерных периодических структур, применявшихся в рентгеноструктурном анализе биомолекул .

История изучения

В 1964 году английский учёный (1932—2014) предположил структуру соединения, которая теперь носит его имя, как часть своей модели гомологичной рекомбинации, разработанной на его исследованиях грибов и Saccharomyces cerevisiae . Эта модель рассматривала молекулярные механизмы кроссинговера и конверсии генов. Холлидей понял, что в ходе кроссинговера должны образовываться гетеродуплексы ДНК с некоторыми неспаренными основаниями ввиду небольших различий между вариантами ( аллелями ) одного гена . Он предположил, что в клетке должен существовать механизм исправления неспаренных оснований, и такой механизм, действительно, был открыт . До модели Холлидея господствовала модель избирательного копирования, согласно которой новая цепь синтезировалась непосредственно из частей различных родительских цепей .

В оригинальной модели Холлидея гетеродуплексная ДНК образовывалась в обеих гомологичных хромосомах, однако экспериментальные данные, полученные на дрожжах, опровергли это. В 1975 году Метью Мезельсон и Чарли Рэддинг обновили модель и ввели идею миграции цепей . Дальнейшие наблюдения привели в 1980-е годы к разработке альтернативных моделей рекомбинации — таких, как модель двуцепочечных разрывов и модель выпрямления цепей. Третья модель — модель синтезозависимого выпрямления цепей — не предполагала образования соединений Холлидея .

Первое экспериментальное доказательство существования соединений Холлидея было получено в конце 1970-х годов при помощи электронной микроскопии , где на изображениях ДНК плазмид и бактериофагов были отчётливо видны структуры из четырёх цепей. В 1980-е годы были идентифицированы ферменты , отвечающие за инициацию образования соединений Холлидея и связывание с ними. В 1983 году Надриан Симэн впервые получил искусственные структуры Холлидея из синтетических олигонуклеотидов , что открыло возможности для более детального изучения свойств структур Холлидея. Многие ранние исследования соединений Холлидея были основаны на таких методах, как электрофорез , и других. В 1990-х годах стали доступны кристаллография и , а также компьютерные методы молекулярного моделирования .

Первоначально генетики предполагали, что для соединения Холлидея более характерна параллельная, а не антипараллельная конформация , поскольку в этом случае гомологичные дуплексы располагались бы наиболее близко друг к другу. Химический анализ, проведённый в 1980-х годах, показал, что преобладает антипараллельная конформация; эти данные показались столь противоречивыми, что поначалу сам Робин Холлидей отверг их . Впоследствии представление об антипараллельной конформации получило большее признание благодаря данным рентгеноструктурного анализа молекул in vitro . В условиях in vivo ситуация менее однозначна, так как связывающиеся с соединениями Холлидея белки могут менять их конформацию .

Концептуальные основы использования соединений Холлидея в ДНК-нанотехнологиях были заложены Симэном в начале 1980-х годов. В 1982—1983 годах были разработаны и созданы неподвижные соединения Холлидея .

Примечания