Замкнутая нуклеиновая кислота ( англ. locked nucleic acid , LNA), также известная как мостиковая нуклеиновая кислота (BNA) и часто называемая недоступной РНК , представляет собой модифицированный нуклеотид РНК , в котором фрагмент рибозы модифицирован дополнительным мостиком, соединяющим 2'-кислородную группу. и 4' углерод. Мостик «запирает» рибозу в 3'- эндо (северной) конформации, которая часто встречается в дуплексах А-формы . Эта структура обеспечивает повышенную устойчивость к ферментативному расщеплению . LNA также предлагает повышенную специфичность и аффинность при спаривании оснований в качестве мономера или компонента олигонуклеотида . Нуклеотиды LNA могут быть смешаны с остатками ДНК или РНК в олигонуклеотиде.

Синтез

Обика и др. были первыми, кто химически синтезировал LNA в 1997 году , а в 1998 году независимо друг от друга последовала группа Джеспера Венгеля . Это стало возможным после того, как Замечник и Стивенсон в 1978 году заложили основу для возможности того, что олигонуклеотиды могут быть отличными агентами для контроля экспрессии генов . На сегодняшний день было показано, что два разных подхода, называемые соответственно линейной и конвергентной стратегиями, обеспечивают высокую производительность и эффективность LNA. Линейная стратегия синтеза была впервые подробно описана в работах Обика и др. В этом подходе в качестве исходного материала можно использовать уридин (или любой доступный нуклеозид РНК). Конвергентная стратегия требует синтеза промежуточного сахара, который служит донором , необходимым для связывания с азотистыми основаниями . Обычно D-глюкоза используется для получения промежуточного сахара, который впоследствии реагирует с азотистыми основаниями с использованием модифицированной процедуры Форбрюгена, позволяющей стереоселективное связывание .

Добавление различных фрагментов остается возможным при сохранении ключевых физико-химических свойств, таких как высокое сродство и специфичность, очевидные в первоначально синтезированном LNA . Такие олигомеры синтезируются химическим путем и коммерчески доступны.

Включение в ДНК/РНК

LNA может быть включен в ДНК и РНК с помощью неразборчивости определённых ДНК- и РНК-полимераз. ДНК-полимераза Phusion, коммерчески разработанный фермент, основанный на , эффективно включает LNA в ДНК .

Характеристики

LNA обеспечивает повышенную биостабильность по сравнению с биологическими нуклеиновыми кислотами . Олигонуклеотиды, модифицированные LNA, продемонстрировали улучшенную термодинамику при гибридизации с РНК , одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК .

Применение

LNAзимы

могут быть модифицированы для включения остатков LNA с образованием LNAзимов (LNA-модифицированных ДНКзимов). Эти модифицированные олигонуклеотиды, как и их родственные ДНКзимы, обычно представляют собой эндонуклеазы , которые связываются со специфическими целевыми последовательностями РНК и расщепляют , существующую между нуклеотидами . Однако они демонстрируют более эффективное расщепление фосфодиэфирных связей по сравнению с их немодифицированными аналогами . Модификация плеч распознавания субстрата мономерами LNA дает LNAзим, который распознает вирус Коксаки A21 (CAV-21) и расщепляет его целевую последовательность РНК , аналогичную последовательности в 5'-нетранслируемой области (5’UTR) риновируса человека −14 (ВСР-14); последовательность, не распознаваемая немодифицированными ДНКзимами .

Терапия

Терапевтическое использование олигонуклеотидов на основе LNA является новой областью биотехнологии . Различные олигонуклеотиды LNA были оценены на предмет их фармакокинетических профилей и профилей токсичности. Исследования пришли к выводу, что токсичность LNA обычно не зависит от последовательности олигонуклеотидов и демонстрирует предпочтительный профиль безопасности для переводимых терапевтических применений .

LNA был исследован на предмет его терапевтических свойств при лечении рака и инфекционных заболеваний. Заблокированная антисмысловая молекула фосфоротиоата нуклеиновой кислоты, названная SPC2996, была разработана для нацеливания на мРНК , кодирующую онкобелок Bcl-2, белок, который ингибирует апоптоз в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ). Клинические испытания фазы I и II продемонстрировали дозозависимое снижение циркулирующих клеток ХЛЛ примерно у 30 % выборки, что предполагает дальнейшее изучение SPC2996 .

LNA также был применен к Miravirsen , экспериментальному терапевтическому средству, предназначенному для лечения гепатита C , представляющему собой 15-нуклеотидную фосфоротиоатную последовательность со специфичностью связывания с MiR-122 ( миРНК , экспрессируемая в гепатоцитах ) .

Обнаружение и диагностика

Аллель-специфическая ПЦР с использованием LNA позволяет создавать более короткие праймеры без ущерба для специфичности связывания .

LNA был включен в флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) . FISH — это распространенный метод, используемый для визуализации генетического материала в различных клетках, но исследования показали, что этот метод был ограничен низкой эффективностью гибридизации зондов. Наоборот, зонды с включением LNA продемонстрировали повышенную эффективность гибридизации как в ДНК , так и в РНК . Улучшенная эффективность FISH с включением LNA привела к FISH-анализу хромосом человека, нескольких типов нечеловеческих клеток и микрочипов .

Также были проведены анализы генотипирования LNA, специально для обнаружения мутации в аполипопротеине B .

Из-за его высокой способности к различению несоответствий LNA был изучен на предмет его применения в диагностических инструментах. Иммобилизованные зонды LNA были введены в мультиплексный анализ .

Редактирование генов

LNA-модифицированные ssODN (синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК) можно использовать, как и обычные ssODN, для редактирования генов с одним основанием. Использование LNA в предполагаемом месте модификации или рядом с ним позволяет избежать репарации несоответствия ДНК из-за более высокой термодинамической стабильности, которой он обладает .

Использованная литература