Interested Article - Транскриптомика одиночных клеток

elizabeth
  • 2020-08-17
  • 1

Транскрипто́мика одино́чных кле́ток ( англ. single-cell transcriptomics ) — область биологических исследований, в которой основным инструментом служат методы количественного анализа экспрессии генов в индивидуальных клетках . Изучение транскриптома отдельных клеток позволяет решить проблему «усреднённых» данных, которые получаются при анализе тотальной РНК , выделенной из образца . Секвенирование РНК одиночных клеток сделало возможными анализ клеточного многообразия в популяциях клеток, считавшихся ранее однородными, например, были получены новые данные в областях иммунологических , эмбриологических и онкологических исследований . Развитие технологий с 2009 года, когда впервые было произведено секвенирование транскриптома одиночных клеток, по наше время позволило увеличить производительность эксперимента от единиц до сотен тысяч клеток, что существенно повысило точность получаемых данных .

Появление новых технологий секвенирования РНК единичных клеток позволило существенно увеличить количество клеток в эксперименте . По вертикальной оси показано количество клеток в эксперименте, по горизонтальной — дата публикации работы, представляющей новый метод секвенирования РНК одиночных клеток.

* 2009 — Впервые проведено секвенирование РНК отдельных клеток.
* 2010 — Количество клеток в эксперименте увеличено до ~100 за счёт параллельной обработки образцов.
* 2011 — Технология STRT-Seq: улучшенное покрытие 5' конца .
* 2012 — Технология SMART-Seq: амплификация с полным покрытием , технология CEL-seq — избавление от систематических ошибок при ПЦР с помощью in vitro транскрипции.
* 2013 — Технологии SMART-Seq2 — удешевление процесса, улучшенная чувствительность. Секвенирование на коммерческой платформе Fluidigm C1 с использованием микрочастиц жидкости позволило увеличить количество клеток в эксперименте до ~1000, .
* 2014 — Появление технологий с использованием уникальных молекулярных идентификаторов (англ. UMI): MARS-Seq, CEL-Seq UMI, STRT-Seq UMI .
* 2015 — Технологии CytoSeq, Drop-seq, inDrop: увеличение производительности до сотен клеток за счёт использования наночастиц жидкости и иммобилизованных праймеров .
* 2017 — усовершенствование технологий, in situ баркодирование. Производительность увеличена до ~1000000 клеток.

Технология анализа транскриптома единичных клеток с помощью количественной ПЦР

Количественная ПЦР применяется для анализа транскриптома единичных клеток реже, чем секвенирование. Для проведения эксперимента требуется выделение одиночных клеток, их лизис , обратная транскрипция РНК. Этот метод достаточно чувствительный, он может быть использован на микрофлюидных технологиях, однако он не позволяет исследовать весь транскриптом, а только детектировать количество конкретных транскриптов, к которым подобраны зонды или праймеры . При этом уровень экспрессии изучаемых генов определяется не абсолютно, а относительно гена .

Количественная ПЦР может также применяться для валидации данных секвенирования РНК .

Технология секвенирования РНК отдельных клеток

Схема эксперимента секвенирования РНК одиночных клеток

Общий алгоритм секвенирования РНК одиночных клеток включает в себя 8 последовательных этапов :

  1. Выделение единичных клеток;
  2. Лизис единичных клеток;
  3. Выделение интересующей фракции РНК с помощью специальных праймеров;
  4. Синтез кДНК с помощью обратной транскрипции ;
  5. Амплификация кДНК;
  6. Подготовка библиотеки кДНК;
  7. Секвенирование ;
  8. Биоинформатическая обработка полученных и анализ данных .

Различные методы подготовки библиотек для секвенирования РНК одиночных клеток отличаются по своей специфичности, точности, стоимости и другим параметрам. Например, Smart-seq2 отличается высокой чувствительностью, а Drop-seq и другие микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц очень высокопроизводительны .

Выделение отдельных клеток

Перед разделением клеток нужно прервать контакты между ними и избавиться от межклеточного вещества. Это может быть достигнуто с помощью ферментирования образца ткани , а также путём специфических манипуляций, таких как, например, лазерная захватывающая микродиссекция , которая позволяет выделять клетки из образца твёрдой ткани с помощью лазера . После получения клеточной суспензии клетки разделяют с помощью различных методов .

  • Метод предельного разбавления ( англ. limiting dilution ). Этот метод заключается в том, что из разбавленной клеточной суспензии пипеткой выделяются отдельные клетки. Процедура производится вручную .
  • Микроманипуляция ( англ. micromanipulation ). Это метод ручного выделения клеток из ткани под микроскопом . Он обычно используется для выделения клеток ранних эмбрионов или отбора клеток некультивируемых микроорганизмов .
Методы выделения одиночных клеток
  • ( англ. fluorescence-activated cell sorting (FACS) ). Это часто используемый высокопроизводительный метод. Перед сортировкой клетки метят с помощью моноклональных антител к поверхностным , антитела снабжены флуоресцентными метками . Механическая сортировка происходит следующим образом. Суспензию клеток помещают в прибор, который выбрасывает капли, содержащие по одной клетке, через наконечник специального «распылителя». Эти капли проходят через луч лазера, и, в зависимости от типа (или их совокупности) на клетке, капля получает заряд , который заставляет её притягиваться к одной из отклоняющих пластин, в результате чего она попадает в конкретный собирающий сосуд. Возможно также производить негативный отбор и выделять клетки, не несущие маркеров. Данный метод не позволяет работать с образцами малого объёма (требуется подавать на вход около 10000 клеток) и требует наличия антител к поверхностным белкам .
  • Микрофлюидные технологии ( англ. microfluidic technology ). Это также высокопроизводительный метод, использующийся наряду с FACS. Он основан на изоляции клеток в микрокаплях буфера , погружённых в гидрофобную среду (масло). Разделение происходит в трубках, диаметр которых подобран так, чтобы капли, содержащие клетки, не сливались друг с другом. Капля раствора, в которую помещается клетка, содержит реакционную смесь для лизиса, выделения РНК и синтеза кДНК. Такой принцип используется в коммерческом аппарате Fluidigm C1 и позволяет обрабатывать до 1000 клеток параллельно .
  • Микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц ( англ. microdroplet-based microfluidics ). Данный принцип также основан на изоляции клеток в гидрофильных микрочастицах жидкости в гидрофобной среде, но помимо клеток, в каплю попадает также твёрдая микрочастица с иммобилизированными на ней праймерами. Так же как и в предыдущем случае, в каплях содержатся изолированные клетки, лизирующий буфер и реакционная смесь для обратной транскрипции, в том числе изолированные на микрочастицах праймеры. Этот метод используется в коммерческом аппарате Chromium system from 10× Genomics. Он позволяет работать с каплями меньшего объёма, чем микрофлюидные технологии без микрочастиц, и обрабатывать от 1000 до 1000000 клеток .
  • Микрофлюидные технологии с использованием микроячеек . Данный метод основан на распределении клеток по ячейкам такого размера, который допускает попадание в них не более одной клетки и микрочастицы с иммобилизованными праймерами .
  • Выделение редких циркулирующих опухолевых клеток . Некоторые специфические задачи требуют выделения из популяции очень малочисленных клеток. Например, выделение из крови циркулирующих опухолевых клеток ( англ. circulating tumor cells, CTCs ) производится с помощью добавления к образцу крови антител с магнитными частицами и выделения меченых клеток с помощью магнита . Для опухолевых клеток эпителиального происхождения используются антитела к CD45 − и EpCAM + .

Лизис клеток и выделение РНК

Клетки обычно лизируют химически, помещая их в . Лизирующие буферы могут различаться по качеству сохранения содержимого клетки и эффективности дальнейших процедур, проводимых с лизатом . Оптимальные протоколы лизиса одиночных клеток эукариот и прокариот также различны, так как требуется разрушить массивную и часто покрытую защитными оболочками клеточную стенку прокариот, при этом не повредив выделяемый материал .

Выделение РНК при подготовке образцов происходит не отдельным техническим этапом, а получается за счёт использования специальных праймеров для инициации обратной транскрипции .

Схема методов подготовки библиотек кДНК, применяемых в секвенировании РНК одиночных клеток

Получение кДНК

После выделения РНК необходимо получить из неё комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции . Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей M-MuLV . Для инициации синтеза используются праймеры, имеющие в своей последовательности баркоды , иногда и последовательности , позволяющие отобрать интересующую нас фракцию РНК. Обычно нужно избавиться от рРНК и тРНК , которые составляют до 95 % выделенной тотальной РНК клетки. Этого можно достичь, используя праймеры с поли(d T )-участком, что позволяет выделить полиаденилированную фракцию. Однако при этом теряется неполиаденилированная РНК (длинные некодирующие РНК и другие), поэтому в ряде протоколов, например, SUPeR-seq, в последовательности праймеров после поли(dT)-участка добавляется несколько (5—6) случайных нуклеотидов .

Синтез второй цепи кДНК осуществляется различными способами. Часто используется ( англ. template switching ), например, в технологиях STRT, Smart-seq и Smart-seq2. Он основан на свойстве ревертазы M-MuLV добавлять на 3’-конец синтезируемой цепи нематричные остатки цитозина . Соответственно, это делает возможным синтез второй цепи с поли(dG)-праймеров .

Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы

Технология высокопроизводительного секвенирования предполагает совместное секвенирование , полученных из разных клеток. Поэтому для различения транскриптов , пришедших из каждой конкретной клетки, используются уникальные клеточные баркоды . В экспериментах по дифференциальной экспрессии помимо баркодов используются так называемые уникальные молекулярные идентификаторы ( англ. unique molecular identifiers, UMIs ). UMI представляет собой последовательность из 4—8 случайных нуклеотидов (например, 5 нуклеотидов дают 4 5 =1024 уникальные последовательности). Сочетание UMI и клеточного баркода статистически получается уникальным для каждого транскрипта, что позволяет сравнивать уровни экспрессии генов по количеству UMI, «пришитых» к транскриптам определённого типа. Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы вносятся в образец на этапе обратной транскрипции, так как составляют часть праймера для синтеза первой цепи кДНК .

Схема эксперимента с использованием микрофлюидных технологий и микрочастицы с иммобилизованными праймерами, в последовательности которых зашифрованы клеточные баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) .

Амплификация кДНК

В ряд технологий, таких как MARS-seq, CEL-seq и CEL-seq2, для амплификации кДНК используется in vitro транскрипция ( англ. in vitro transcription, IVT ) . Это способ основан на транскрипции кДНК фаговой и повторении этапа обратной транскрипции. Для осуществления in vitro транскрипции в поли(dT)-праймер вносится промотор Т7. Увеличение количества кДНК в данном случае происходит линейно .

Амплификация кДНК может также осуществляться с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, в Drop-seq, SCRB-seq, SMART-seq и SMART-seq2. Однако этот метод часто вносит искажения в отношение количества транскриптов. С этими искажениями позволяет бороться использование уникальных молекулярных идентификаторов .

Для работы с прокариотическими клетками используются также специальные методы, такие как амплификация по типу катящегося кольца .

Подготовка геномной библиотеки и секвенирование

В зависимости от способа подготовки библиотеки происходит секвенирование полноразмерных транскриптов, или фракции, обогащённой 3’- или 5’-фрагментами . Обогащение полноразмерными транскриптами (технологии SMART-seq, SMART-seq2) требуется при изучении альтернативного сплайсинга и однонуклеотидных полиморфизмов , тогда как секвенирование 3’-фрагментов (технологии CEL- seq, CEL-seq2, MARS-seq) и 5’-фрагментов (технология STRT) подходят для выявления дифференциальной экспрессии. Эти методы, как правило, используют уникальные молекулярные идентификаторы. Подготовленные библиотеки обрабатывают методами секвенирования нового поколения (англ. next generation sequencing, NGS), часто используется секвенирование на платформе Illumina . Полученные «сырые» прочтения обрабатывают методами биоинформатики .

Анализ данных

Различные этапы исследования РНК отдельных клеток, на которых применяются методы биоинформатики
А . Контроль качества результатов эксперимента
Б . Примеры исследования гетерогенных популяций клеток: разные клеточные типы, спектр состояний клеток в ткани, спектр состояний клеток при развитии или ином биологическом процессе
В . Анализ источников и уровня шума: биологического и технического

Первоочередной задачей при биоинформатическом анализе результатов секвенирования РНК одиночных клеток является получение матрицы экспрессий генов из прочтений секвенатора. После получения такой матрицы имеют место несколько направлений анализа :

  1. Анализ на клеточном уровне: кластеризация, классификация и определение клеточных траекторий;
  2. Анализ на уровне генов: определение дифференциально экспрессирующихся генов, регуляторных сетей.

Получение матрицы экспрессии генов

Стандартный протокол обработки прочтений, получаемых при секвенировании, включает в себя несколько шагов (в скобках приведены программы, использующиеся на каждом этапе) :

  1. Контроль качества прочтений ( , );
  2. Картирование прочтений на ( , и другие);
  3. Подсчёт количества транскриптов исследуемых генов для каждой из клеток (используя характеристики покрытия или число уникальных молекулярных идентификаторов);
  4. При необходимости (например, если два набора данных были получены в разных местах и разными учёными) — поправка систематической ошибки ( );
  5. В случае, если использовался протокол без уникальных молекулярных идентификаторов, необходима нормализация матрицы ( , );
  6. Восстановление пропущенных данных ( ) ( , ).
Нормированная и центрированная матрица генной экспрессии. Строки — это анализируемые гены, столбцы — это анализируемые клетки. Цветом условно изображён уровень экспрессии гена в клетке
Иерархическая кластеризация клеток по профилям экспрессии генов

Контроль качества прочтений

При картировании обеспечивается контроль качества прочтения транскриптома каждой клетки, клетки с низким качеством прочтения исключаются из дальнейшего анализа . Для контроля качества могут использоваться разные метрики:

  • количество прочтений на клетку;
  • количество найденных генов;
  • отношение количества всех прочтений к количеству прочтений митохондриальной РНК (высокое отношение может означать утечку цитоплазматических РНК или протекание апоптоза в клетке);
  • калибровка количества всех прочтений к РНК, количество и последовательность которой известна ;
  • использование UMI (уникальных молекулярных идентификаторов).

Обработка данных с применением UMI и клеточных баркодов

Последовательно выполняются следующие шаги :

  1. Проводится обратная транскрипция, UMI и клеточные баркоды находятся на праймере и входят в состав кДНК;
  2. Прочтения сортируются по UMI и клеточным баркодам, удаляются ПЦР-дубликаты: прочтения с одинаковым клеточным баркодом и UMI;
  3. Для каждой клетки строится матрица, характеризующая количество прочтений (у каждого оставшегося прочтения уникальное сочетание «клеточный баркод + UMI») каждого найденного гена.
Основные этапы анализа данных scRNA-seq с использованием UMI и клеточного баркодирования

Анализ на клеточном уровне

Кластеризация

С целью выявления клеточных субпопуляций обычно проводится кластеризация клеток по схожести их профилей экспрессии генов . Эта кластеризация может проводиться многими способами: методом k-средних , с использованием графа ближайших соседей , иерархической кластеризацией и некоторыми другими. Несмотря на обилие подходов, кластеризация получается не всегда: структура данных может скрываться за техническим шумом или систематическими ошибками ; также анализ затрудняется из-за проклятия размерности . Для сглаживания этих эффектов размерность транскриптомного пространства, элементами которого являются клетки, понижается .

Примеры результатов снижения размерности с использованием метода главных компонент (слева) и алгоритма t-SNE (справа) на одинаковых данных

Уменьшение размерности

При выполнении формальных математических операций классификации, поиска корреляций принимается, что каждая клетка — это вектор в n-мерном пространстве , где n соответствует числу анализируемых генов, а координаты клетки — это уровни экспрессий соответствующих генов в ней . Как уже было сказано, снижение размерности может помочь восстановить структуру данных и уменьшить шумы, и потому размерность векторов экспрессий имеет смысл понижать (при помощи метода главных компонент , t -SNE , многомерного шкалирования , UMAP и других).

Дифференциальная экспрессия генов

Важной задачей является поиск дифференциально экспрессирующихся генов, то есть таких генов, которые статистически достоверно экспрессируются в разных группах клеток с разной силой. Такие гены часто характеризуют особенности рассматриваемых клеток и являются их маркерами . Сначала для идентификации дифференциальной экспрессии использовали инструменты, созданные для работы с транскриптомикой тканей и органов ; сейчас существует ряд методов ( , ), созданных для поиска дифференциальной экспрессии в данных секвенирования именно отдельных клеток.

Анализ на уровне генов

Генные регуляторные сети

— это совокупность молекулярных регуляторов, взаимодействующих друг с другом и другими веществами в клетке, регулируя уровни экспрессии . Эти регуляторы играют центральную роль в морфогенезе частей тела и органов живых организмов и являются одним из центральных предметов изучения эволюционной биологии развития . Генную регуляторную сеть можно представить как граф , в котором вершины — это гены, а рёбра — это их ко-регуляция. Существуют методы, определяющие регуляторные сети при помощи поиска корреляций между экспрессиями генов, однако такой подход не позволяет детектировать нелинейные взаимодействия, поэтому сейчас возникли подходы, основанные на машинном обучении , вероятностных моделях , а также теории информации .

Поиск траекторий дифференцировок клеток

Клетки постоянно находятся в динамических процессах и реагируют на различные воздействия окружающей среды. Эти процессы сопровождаются и изменением профиля транскрипции клетки. Сама постановка эксперимента по секвенированию РНК одиночных клеток позволяет захватывать клетки в их разные стадии дифференцировки . Когда промежуточных стадий отсеквенировано достаточно много, можно отследить путь дифференцировки клетки в транскриптомном пространстве в течение «псевдовремени» . Этот инструментарий помогает изучать механизмы онтогенеза в частности и формирования различий в общем. Сейчас существует множество различных подходов к реконструкции таких траекторий .

Применение

Исследования дифференцировки стволовых клеток

Отличия между отдельными клетками — фундаментальная характеристика популяций стволовых клеток , но эти отличия размываются при традиционном анализе ансамблей клеток. Секвенирование РНК одиночных клеток позволяет выявлять эти отличия и обнаруживать различные фенотипы стволовых клеток даже в пределах «однородной» популяции .

Так, были выявлены значительные различия между долгоживущими и короткоживущими гематопоэтическими стволовыми клетками мыши и определено, что основной вклад в эти различия вносят гены, отвечающие за клеточный цикл . Секвенирование РНК одиночных клеток было применено для изучения лёгких мыши и позволило найти ранее неизвестные маркеры, специфичные для различных подтипов клеток. Были также исследованы различных видов и их траектории развития . В другом исследовании было проведено сравнение смен стадий нейронных стволовых клеток у здоровых мышей и мышей, перенёсших .

Исследования эмбриогенеза

Процесс эмбрионального развития можно рассматривать как переход от уровня отдельных клеток к уровню организма. Для изучения ранних стадий эмбрионального развития необходимы методы, способные работать с небольшим количеством доступных клеток. С помощью секвенирования РНК одиночных клеток удалось провести общий анализ раннего развития млекопитающих . Были получены профили экспрессии генов для клеток человека и мыши периода предимплантационного развития , а также для первичных половых клеток человека в период перехода от стадии миграции к стадии гонад . На клетках мышиных эмбрионов были изучены изменения экспрессии генов в период (процесс замены зародышем материнских мРНК на свои собственные). Было показано, что в эмбрионе мыши активация зиготического генома происходит на стадии 4 клеток, у человека — между четырёх- и восьмиклеточной стадиями . Для нематоды Caenorhabditis elegans был составлен молекулярный атлас её эмбрионального развития с клеточным разрешением .

Анализ тканей

Изучение транскриптома всех клеток ткани даёт возможность узнать больше о иерархии клеточных линий с высокой точностью. Параллельные исследования транскриптомики отдельных клеток селезёнки без предварительного отбора клеток, основанного на заранее выбранных клеточных маркерах, в сочетании с иерархической кластеризацией позволило воссоздать общую структуру взаимоотношений клеточных линий селезёнки .

Онкологические исследования

Ткань злокачественной опухоли обычно состоит из нескольких популяций клеток, отличающихся друг от друга функционально и фенотипически. Согласно современным представлениям, процесс развития опухоли может иметь в своей основе не только клональную эволюцию мутировавших клеток исходной ткани, но и иерархическую дифференцировку так называемых (РСК). Согласно концепции РСК, любое злокачественное новообразование развивается из одной клетки-предшественника популяции РСК, а опухоль устроена иерархически, то есть разные типы раковых клеток обладают разной способностью к делению . Секвенирование РНК одиночных клеток позволяет выявлять отдельные РСК, а также анализировать различные популяции клеток, находящиеся в одной опухоли .

Так, недавно были проанализированы транскриптомные профили сотен отдельных опухолевых клеток пяти пациентов с глиобластомой , что позволило выявить дифференциальную экспрессию генов, связанных с онкогенным сигнализированием, пролиферацией , комплементным и иммунным ответом и гипоксией . Также были обнаружены клетки с фенотипами, промежуточными между мезенхимальным и эпителиальным , что не соответствует классической модели эпителиально-мезенхимального перехода с двумя дискретными состояниями клеток. Кроме того, был получен набор генов «стволовости», и клетки также распределялись по непрерывной, а не дискретной шкале уровней экспрессии этих генов, что отражает сложный характер системы стволовых клеток в опухоли .

На данный момент существует несколько моделей метастазирования , таких как позднее распространение, ранний сев и самосев, однако до сих пор сложно объяснить ими метастазирование в большинстве видов рака у человека. Трудности заключаются как в упомянутой выше гетерогенности клеток в пределах самой опухоли, так и в сложности анализа ключевых агентов метастазирования — (ЦОК): эти клетки исключительно редко встречаются в крови (одна на миллион) .

Тем не менее, в недавнем исследовании с помощью секвенирования РНК одиночных клеток удалось выявить три различные генетические подписи в ЦОК, ассоциированные с метастазированием, у пациентов с меланомой . В другом исследовании изучалось распространение отдельных циркулирующих опухолевых клеток и их кластеров в метастатическом раке молочной железы человека, в том числе с использованием мышиных моделей. Было показано, что кластеры имеют повышенный метастатический потенциал по сравнению с отдельными ЦОК, а также что регулирует образование таких кластеров . Исследование отдельных ЦОК метастатического рака поджелудочной железы показало, что эти клетки экспрессируют особые собственные белки внеклеточного матрикса . Подобные результаты позволяют лучше понять функционирование РСК и генетические взаимосвязи между клетками исходной опухоли и метастазов.

Отдельная тема онкологических исследований — приобретение клетками опухоли устойчивости к химиотерапии . Этот процесс также до сих пор плохо изучен для большинства видов рака у человека. В одном из последних исследований были проанализированы транскриптомные профили нескольких сотен отдельных клеток клеточной линии аденокарциномы лёгкого и выявлены новые сигнальные пути , ассоциированные с устойчивостью к определённым компонентам химиотерапии . Исследование ЦОК рака предстательной железы выявило активацию неканонического сигнального пути Wnt , способствующую устойчивости к лекарствам на основе антиандрогена .

Исследования альтернативного сплайсинга

Большинство генов эукариот подвержены альтернативному сплайсингу — явлению, позволяющему комбинировать экзоны гена в разных комбинациях, вследствие чего с одного гена появляется возможность производить различные транскрипты и, следовательно, различные белки с потенциально разными функциями. Несмотря на то, что некоторые методы секвенирования РНК одиночных клеток (например, SMART-Seq) имеют близкое к полному транскриптома, анализ альтернативных изоформ затруднён из-за перечисленных ранее ограничений методов. Например, транскрипты, присутствующие в малом количестве, могут быть не обнаружены из-за неотличимости от биологического шума. Однако, уже разрабатываются модели, учитывающие распределения транскриптов в объединённом множестве отдельно секвенированных клеток . Они позволят точнее предсказывать число различных изоформ в отдельных клетках .

Иммунология

Секвенирование РНК одиночных клеток может использоваться для эффективного анализа иммунного ответа клеток одной популяции, находящихся в разных условиях. Так, в недавнем исследовании изучалась динамика взаимодействия макрофагов сальмонеллы с клетками-хозяевами c различными модификациями липополисахаридов (основного компонента клеточной стенки) . В другом исследовании изучалась реакция на липополисахариды дендритных клеток костного мозга мышей .

См. также

Примечания

  1. ↑ Haque Ashraful , Engel Jessica , Teichmann Sarah A. , Lönnberg Tapio. (англ.) // Genome Medicine. — 2017. — 18 August ( vol. 9 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  2. Herr Amy E. , Kitamori Takehiko , Landegren Ulf , Kamali-Moghaddam Masood. (англ.) // The Analyst. — 2019. — Vol. 144 , no. 3 . — P. 735—737 . — ISSN . — doi : . [ ]
  3. Chen Haide , Ye Fang , Guo Guoji. (англ.) // Cellular & Molecular Immunology. — 2019. — 22 February ( vol. 16 , no. 3 ). — P. 242—249 . — ISSN . — doi : . [ ]
  4. Kumar Pavithra , Tan Yuqi , Cahan Patrick. (англ.) // Development. — 2017. — 1 January ( vol. 144 , no. 1 ). — P. 17—32 . — ISSN . — doi : . [ ]
  5. ↑ Svensson Valentine , Vento-Tormo Roser , Teichmann Sarah A. (англ.) // Nature Protocols. — 2018. — 1 March ( vol. 13 , no. 4 ). — P. 599—604 . — ISSN . — doi : . [ ]
  6. ↑ Hedlund Eva , Deng Qiaolin. (англ.) // Molecular Aspects of Medicine. — 2018. — February ( vol. 59 ). — P. 36—46 . — ISSN . — doi : . [ ]
  7. ↑ Hwang Byungjin , Lee Ji Hyun , Bang Duhee. (англ.) // Experimental & Molecular Medicine. — 2018. — August ( vol. 50 , no. 8 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  8. Kolodziejczyk Aleksandra A. , Kim Jong Kyoung , Svensson Valentine , Marioni John C. , Teichmann Sarah A. (англ.) // Molecular Cell. — 2015. — May ( vol. 58 , no. 4 ). — P. 610—620 . — ISSN . — doi : . [ ]
  9. ↑ Zhang Xiannian , Li Tianqi , Liu Feng , Chen Yaqi , Yao Jiacheng , Li Zeyao , Huang Yanyi , Wang Jianbin. (англ.) // Molecular Cell. — 2019. — January ( vol. 73 , no. 1 ). — P. 130—142.e5 . — ISSN . — doi : . [ ]
  10. White A. K. , VanInsberghe M. , Petriv O. I. , Hamidi M. , Sikorski D. , Marra M. A. , Piret J. , Aparicio S. , Hansen C. L. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2011. — 1 August ( vol. 108 , no. 34 ). — P. 13999—14004 . — ISSN . — doi : . [ ]
  11. Sanchez-Freire Veronica , Ebert Antje D , Kalisky Tomer , Quake Stephen R , Wu Joseph C. (англ.) // Nature Protocols. — 2012. — 5 April ( vol. 7 , no. 5 ). — P. 829—838 . — ISSN . — doi : . [ ]
  12. Everaert Celine , Luypaert Manuel , Maag Jesper L. V. , Cheng Quek Xiu , Dinger Marcel E. , Hellemans Jan , Mestdagh Pieter. (англ.) // Scientific Reports. — 2017. — 8 May ( vol. 7 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  13. Kameishi Sumako , Umemoto Terumasa , Matsuzaki Yu , Fujita Masako , Okano Teruo , Kato Takashi , Yamato Masayuki. (англ.) // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2016. — May ( vol. 473 , no. 3 ). — P. 704—709 . — ISSN . — doi : . [ ]
  14. Ziegenhain Christoph , Vieth Beate , Parekh Swati , Reinius Björn , Guillaumet-Adkins Amy , Smets Martha , Leonhardt Heinrich , Heyn Holger , Hellmann Ines , Enard Wolfgang. (англ.) // Molecular Cell. — 2017. — February ( vol. 65 , no. 4 ). — P. 631—643.e4 . — ISSN . — doi : . [ ]
  15. ↑ Gao Dan , Jin Feng , Zhou Min , Jiang Yuyang. (англ.) // The Analyst. — 2019. — Vol. 144 , no. 3 . — P. 766—781 . — ISSN . — doi : . [ ]
  16. Svec David , Andersson Daniel , Pekny Milos , Sjöback Robert , Kubista Mikael , Ståhlberg Anders. (англ.) // Frontiers in Oncology. — 2013. — Vol. 3 . — ISSN . — doi : . [ ]
  17. ↑ Zhang Yi , Gao Jiaxin , Huang Yanyi , Wang Jianbin. (англ.) // Biophysical Journal. — 2018. — July ( vol. 115 , no. 2 ). — P. 173—180 . — ISSN . — doi : . [ ]
  18. ↑ Zajac Pawel , Islam Saiful , Hochgerner Hannah , Lönnerberg Peter , Linnarsson Sten. (англ.) // PLoS ONE. — 2013. — 31 December ( vol. 8 , no. 12 ). — P. e85270 . — ISSN . — doi : . [ ]
  19. ↑ Chen Geng , Ning Baitang , Shi Tieliu. (англ.) // Frontiers in Genetics. — 2019. — 5 April ( vol. 10 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  20. Kim Daehwan , Pertea Geo , Trapnell Cole , Pimentel Harold , Kelley Ryan , Salzberg Steven L. (англ.) // Genome Biology. — 2013. — Vol. 14 , no. 4 . — P. R36 . — ISSN . — doi : . [ ]
  21. Kim Daehwan , Langmead Ben , Salzberg Steven L. (англ.) // Nature Methods. — 2015. — 9 March ( vol. 12 , no. 4 ). — P. 357—360 . — ISSN . — doi : . [ ]
  22. Büttner Maren , Miao Zhichao , Wolf F. Alexander , Teichmann Sarah A. , Theis Fabian J. (англ.) // Nature Methods. — 2018. — 20 December ( vol. 16 , no. 1 ). — P. 43—49 . — ISSN . — doi : . [ ]
  23. Bacher Rhonda , Chu Li-Fang , Leng Ning , Gasch Audrey P , Thomson James A , Stewart Ron M , Newton Michael , Kendziorski Christina. (англ.) // Nature Methods. — 2017. — 17 April ( vol. 14 , no. 6 ). — P. 584—586 . — ISSN . — doi : . [ ]
  24. Katayama Shintaro , Töhönen Virpi , Linnarsson Sten , Kere Juha. (англ.) // Bioinformatics. — 2013. — 31 August ( vol. 29 , no. 22 ). — P. 2943—2945 . — ISSN . — doi : . [ ]
  25. van Dijk David , Sharma Roshan , Nainys Juozas , Yim Kristina , Kathail Pooja , Carr Ambrose J. , Burdziak Cassandra , Moon Kevin R. , Chaffer Christine L. , Pattabiraman Diwakar , Bierie Brian , Mazutis Linas , Wolf Guy , Krishnaswamy Smita , Pe’er Dana. (англ.) // Cell. — 2018. — July ( vol. 174 , no. 3 ). — P. 716—729.e27 . — ISSN . — doi : . [ ]
  26. Talwar Divyanshu , Mongia Aanchal , Sengupta Debarka , Majumdar Angshul. (англ.) // Scientific Reports. — 2018. — 5 November ( vol. 8 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  27. Rostom R. , Svensson V. , Teichmann S. A. , Kar G. (англ.) // FEBS Letters. — 2017. — August ( vol. 591 , no. 15 ). — P. 2213—2225 . — doi : . — . [ ]
  28. Zhang X. , Li T. , Liu F. , Chen Y. , Yao J. , Li Z. , Huang Y. , Wang J. (англ.) // Molecular Cell. — 2019. — 3 January ( vol. 73 , no. 1 ). — P. 130—142 . — doi : . — . [ ]
  29. ↑ Ntranos Vasilis , Kamath Govinda M. , Zhang Jesse M. , Pachter Lior , Tse David N. (англ.) // Genome Biology. — 2016. — 26 May ( vol. 17 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  30. Satija Rahul , Farrell Jeffrey A , Gennert David , Schier Alexander F , Regev Aviv. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2015. — 13 April ( vol. 33 , no. 5 ). — P. 495—502 . — ISSN . — doi : . [ ]
  31. Baran Yael , Sebe-Pedros Arnau , Lubling Yaniv , Giladi Amir , Chomsky Elad , Meir Zohar , Hoichman Michael , Lifshitz Aviezer , Tanay Amos. (англ.) . — 2018. — 8 October. — doi : . [ ]
  32. Zhang Jesse M. , Fan Jue , Fan H. Christina , Rosenfeld David , Tse David N. (англ.) // BMC Bioinformatics. — 2018. — 9 March ( vol. 19 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  33. Tung Po-Yuan , Blischak John D. , Hsiao Chiaowen Joyce , Knowles David A. , Burnett Jonathan E. , Pritchard Jonathan K. , Gilad Yoav. (англ.) // Scientific Reports. — 2017. — 3 January ( vol. 7 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  34. Hicks Stephanie C , Townes F. William , Teng Mingxiang , Irizarry Rafael A. (англ.) . — 2015. — 25 August. — doi : . [ ]
  35. Chen Huidong , Albergante Luca , Hsu Jonathan Y. , Lareau Caleb A. , Lo Bosco Giosuè , Guan Jihong , Zhou Shuigeng , Gorban Alexander N. , Bauer Daniel E. , Aryee Martin J. , Langenau David M. , Zinovyev Andrei , Buenrostro Jason D. , Yuan Guo-Cheng , Pinello Luca. (англ.) // Nature Communications. — 2019. — 23 April ( vol. 10 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  36. Lall Snehalika , Sinha Debajyoti , Bandyopadhyay Sanghamitra , Sengupta Debarka. (англ.) // Journal of Computational Biology. — 2018. — December ( vol. 25 , no. 12 ). — P. 1365—1373 . — ISSN . — doi : . [ ]
  37. Kobak Dmitry , Berens Philipp. (англ.) . — 2018. — 25 October. — doi : . [ ]
  38. Wang Bo , Zhu Junjie , Pierson Emma , Ramazzotti Daniele , Batzoglou Serafim. (англ.) . — 2016. — 9 May. — doi : . [ ]
  39. Becht Etienne , McInnes Leland , Healy John , Dutertre Charles-Antoine , Kwok Immanuel W H , Ng Lai Guan , Ginhoux Florent , Newell Evan W. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2018. — 3 December ( vol. 37 , no. 1 ). — P. 38—44 . — ISSN . — doi : . [ ]
  40. Finak Greg , McDavid Andrew , Yajima Masanao , Deng Jingyuan , Gersuk Vivian , Shalek Alex K. , Slichter Chloe K. , Miller Hannah W. , McElrath M. Juliana , Prlic Martin , Linsley Peter S. , Gottardo Raphael. (англ.) // Genome Biology. — 2015. — December ( vol. 16 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  41. Kharchenko Peter V , Silberstein Lev , Scadden David T. (англ.) // Nature Methods. — 2014. — 18 May ( vol. 11 , no. 7 ). — P. 740—742 . — ISSN . — doi : . [ ]
  42. Emmert-Streib Frank , Dehmer Matthias , Haibe-Kains Benjamin. (англ.) // Frontiers in Cell and Developmental Biology. — 2014. — 19 August ( vol. 2 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  43. Kotera Masaaki , Yamanishi Yoshihiro , Moriya Yuki , Kanehisa Minoru , Goto Susumu. (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2012. — 14 June ( vol. 40 , no. W1 ). — P. W162—W167 . — ISSN . — doi : . [ ]
  44. Shmulevich I. , Dougherty E. R. , Kim S. , Zhang W. (англ.) // Bioinformatics. — 2002. — 1 February ( vol. 18 , no. 2 ). — P. 261—274 . — ISSN . — doi : . [ ]
  45. Zhang Xiujun , Zhao Xing-Ming , He Kun , Lu Le , Cao Yongwei , Liu Jingdong , Hao Jin-Kao , Liu Zhi-Ping , Chen Luonan. (англ.) // Bioinformatics. — 2011. — 15 November ( vol. 28 , no. 1 ). — P. 98—104 . — ISSN . — doi : . [ ]
  46. Griffiths Jonathan A , Scialdone Antonio , Marioni John C. (англ.) // Molecular Systems Biology. — 2018. — April ( vol. 14 , no. 4 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  47. Saelens Wouter , Cannoodt Robrecht , Todorov Helena , Saeys Yvan. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019. — 1 April ( vol. 37 , no. 5 ). — P. 547—554 . — ISSN . — doi : . [ ]
  48. Kowalczyk Monika S. , Tirosh Itay , Heckl Dirk , Rao Tata Nageswara , Dixit Atray , Haas Brian J. , Schneider Rebekka K. , Wagers Amy J. , Ebert Benjamin L. , Regev Aviv. (англ.) // Genome Research. — 2015. — 1 October ( vol. 25 , no. 12 ). — P. 1860—1872 . — ISSN . — doi : . [ ]
  49. Tsang Jason C. H. , Yu Yong , Burke Shannon , Buettner Florian , Wang Cui , Kolodziejczyk Aleksandra A. , Teichmann Sarah A. , Lu Liming , Liu Pentao. (англ.) // Genome Biology. — 2015. — 21 September ( vol. 16 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  50. Treutlein Barbara , Brownfield Doug G. , Wu Angela R. , Neff Norma F. , Mantalas Gary L. , Espinoza F. Hernan , Desai Tushar J. , Krasnow Mark A. , Quake Stephen R. (англ.) // Nature. — 2014. — 13 April ( vol. 509 , no. 7500 ). — P. 371—375 . — ISSN . — doi : . [ ]
  51. Shin Jaehoon , Berg Daniel A. , Zhu Yunhua , Shin Joseph Y. , Song Juan , Bonaguidi Michael A. , Enikolopov Grigori , Nauen David W. , Christian Kimberly M. , Ming Guo-li , Song Hongjun. (англ.) // Cell Stem Cell. — 2015. — September ( vol. 17 , no. 3 ). — P. 360—372 . — ISSN . — doi : . [ ]
  52. Llorens-Bobadilla Enric , Zhao Sheng , Baser Avni , Saiz-Castro Gonzalo , Zwadlo Klara , Martin-Villalba Ana. (англ.) // Cell Stem Cell. — 2015. — September ( vol. 17 , no. 3 ). — P. 329—340 . — ISSN . — doi : . [ ]
  53. Deng Q. , Ramskold D. , Reinius B. , Sandberg R. (англ.) // Science. — 2014. — 9 January ( vol. 343 , no. 6167 ). — P. 193—196 . — ISSN . — doi : . [ ]
  54. Xue Zhigang , Huang Kevin , Cai Chaochao , Cai Lingbo , Jiang Chun-yan , Feng Yun , Liu Zhenshan , Zeng Qiao , Cheng Liming , Sun Yi E. , Liu Jia-yin , Horvath Steve , Fan Guoping. (англ.) // Nature. — 2013. — 28 July ( vol. 500 , no. 7464 ). — P. 593—597 . — ISSN . — doi : . [ ]
  55. Tang Fuchou , Barbacioru Catalin , Bao Siqin , Lee Caroline , Nordman Ellen , Wang Xiaohui , Lao Kaiqin , Surani M. Azim. (англ.) // Cell Stem Cell. — 2010. — May ( vol. 6 , no. 5 ). — P. 468—478 . — ISSN . — doi : . [ ]
  56. Tang Fuchou , Barbacioru Catalin , Nordman Ellen , Bao Siqin , Lee Caroline , Wang Xiaohui , Tuch Brian B. , Heard Edith , Lao Kaiqin , Surani M. Azim. (англ.) // PLoS ONE. — 2011. — 23 June ( vol. 6 , no. 6 ). — P. e21208 . — ISSN . — doi : . [ ]
  57. ↑ Yan Liying , Yang Mingyu , Guo Hongshan , Yang Lu , Wu Jun , Li Rong , Liu Ping , Lian Ying , Zheng Xiaoying , Yan Jie , Huang Jin , Li Ming , Wu Xinglong , Wen Lu , Lao Kaiqin , Li Ruiqiang , Qiao Jie , Tang Fuchou. (англ.) // Nature Structural & Molecular Biology. — 2013. — 11 August ( vol. 20 , no. 9 ). — P. 1131—1139 . — ISSN . — doi : . [ ]
  58. Guo Fan , Yan Liying , Guo Hongshan , Li Lin , Hu Boqiang , Zhao Yangyu , Yong Jun , Hu Yuqiong , Wang Xiaoye , Wei Yuan , Wang Wei , Li Rong , Yan Jie , Zhi Xu , Zhang Yan , Jin Hongyan , Zhang Wenxin , Hou Yu , Zhu Ping , Li Jingyun , Zhang Ling , Liu Sirui , Ren Yixin , Zhu Xiaohui , Wen Lu , Gao Yi Qin , Tang Fuchou , Qiao Jie. (англ.) // Cell. — 2015. — June ( vol. 161 , no. 6 ). — P. 1437—1452 . — ISSN . — doi : . [ ]
  59. Biase Fernando H. , Cao Xiaoyi , Zhong Sheng. (англ.) // Genome Research. — 2014. — 5 August ( vol. 24 , no. 11 ). — P. 1787—1796 . — ISSN . — doi : . [ ]
  60. Shi Junchao , Chen Qi , Li Xin , Zheng Xiudeng , Zhang Ying , Qiao Jie , Tang Fuchou , Tao Yi , Zhou Qi , Duan Enkui. (англ.) // Development. — 2015. — 22 September ( vol. 142 , no. 20 ). — P. 3468—3477 . — ISSN . — doi : . [ ]
  61. Packer Jonathan S. , Zhu Qin , Huynh Chau , Sivaramakrishnan Priya , Preston Elicia , Dueck Hannah , Stefanik Derek , Tan Kai , Trapnell Cole , Kim Junhyong , Waterston Robert H. , Murray John I. (англ.) . — 2019. — 1 March. — doi : . [ ]
  62. Jaitin D. A. , Kenigsberg E. , Keren-Shaul H. , Elefant N. , Paul F. , Zaretsky I. , Mildner A. , Cohen N. , Jung S. , Tanay A. , Amit I. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2014. — 14 February ( vol. 343 , no. 6172 ). — P. 776—779 . — doi : . — . [ ]
  63. ↑ . elementy.ru. Дата обращения: 30 апреля 2017. 4 мая 2017 года.
  64. Patel A. P. , Tirosh I. , Trombetta J. J. , Shalek A. K. , Gillespie S. M. , Wakimoto H. , Cahill D. P. , Nahed B. V. , Curry W. T. , Martuza R. L. , Louis D. N. , Rozenblatt-Rosen O. , Suva M. L. , Regev A. , Bernstein B. E. (англ.) // Science. — 2014. — 12 June ( vol. 344 , no. 6190 ). — P. 1396—1401 . — ISSN . — doi : . [ ]
  65. Miller MC, Doyle GV, Terstappen LW (2010). . J Oncol (англ.) . 2010 : 1—8. doi : . PMC . PMID . {{ cite journal }} : Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) ( ссылка )
  66. Ramsköld D. , Luo S. , Wang Y. C. , Li R. , Deng Q. , Faridani O. R. , Daniels G. A. , Khrebtukova I. , Loring J. F. , Laurent L. C. , Schroth G. P. , Sandberg R. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2012. — August ( vol. 30 , no. 8 ). — P. 777—782 . — doi : . — . [ ]
  67. Aceto Nicola , Bardia Aditya , Miyamoto David T. , Donaldson Maria C. , Wittner Ben S. , Spencer Joel A. , Yu Min , Pely Adam , Engstrom Amanda , Zhu Huili , Brannigan Brian W. , Kapur Ravi , Stott Shannon L. , Shioda Toshi , Ramaswamy Sridhar , Ting David T. , Lin Charles P. , Toner Mehmet , Haber Daniel A. , Maheswaran Shyamala. (англ.) // Cell. — 2014. — August ( vol. 158 , no. 5 ). — P. 1110—1122 . — ISSN . — doi : . [ ]
  68. Ting D. T. , Wittner B. S. , Ligorio M. , Vincent Jordan N. , Shah A. M. , Miyamoto D. T. , Aceto N. , Bersani F. , Brannigan B. W. , Xega K. , Ciciliano J. C. , Zhu H. , MacKenzie O. C. , Trautwein J. , Arora K. S. , Shahid M. , Ellis H. L. , Qu N. , Bardeesy N. , Rivera M. N. , Deshpande V. , Ferrone C. R. , Kapur R. , Ramaswamy S. , Shioda T. , Toner M. , Maheswaran S. , Haber D. A. (англ.) // Cell Reports. — 2014. — 25 September ( vol. 8 , no. 6 ). — P. 1905—1918 . — doi : . — . [ ]
  69. Suzuki Ayako , Matsushima Koutatsu , Makinoshima Hideki , Sugano Sumio , Kohno Takashi , Tsuchihara Katsuya , Suzuki Yutaka. (англ.) // Genome Biology. — 2015. — 3 April ( vol. 16 , no. 1 ). — ISSN . — doi : . [ ]
  70. Miyamoto D. T. , Zheng Y. , Wittner B. S. , Lee R. J. , Zhu H. , Broderick K. T. , Desai R. , Fox D. B. , Brannigan B. W. , Trautwein J. , Arora K. S. , Desai N. , Dahl D. M. , Sequist L. V. , Smith M. R. , Kapur R. , Wu C.-L. , Shioda T. , Ramaswamy S. , Ting D. T. , Toner M. , Maheswaran S. , Haber D. A. (англ.) // Science. — 2015. — 17 September ( vol. 349 , no. 6254 ). — P. 1351—1356 . — ISSN . — doi : . [ ]
  71. ↑ Welch Joshua D. , Hu Yin , Prins Jan F. (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2016. — 5 January ( vol. 44 , no. 8 ). — P. e73—e73 . — ISSN . — doi : . [ ]
  72. Marinov G. K. , Williams B. A. , McCue K. , Schroth G. P. , Gertz J. , Myers R. M. , Wold B. J. (англ.) // Genome Research. — 2013. — 3 December ( vol. 24 , no. 3 ). — P. 496—510 . — ISSN . — doi : . [ ]
  73. Avraham R. , Haseley N. , Brown D. , Penaranda C. , Jijon H. B. , Trombetta J. J. , Satija R. , Shalek A. K. , Xavier R. J. , Regev A. , Hung D. T. (англ.) // Cell. — 2015. — 10 September ( vol. 162 , no. 6 ). — P. 1309—1321 . — doi : . — . [ ]
  74. Shalek Alex K. , Satija Rahul , Adiconis Xian , Gertner Rona S. , Gaublomme Jellert T. , Raychowdhury Raktima , Schwartz Schraga , Yosef Nir , Malboeuf Christine , Lu Diana , Trombetta John J. , Gennert Dave , Gnirke Andreas , Goren Alon , Hacohen Nir , Levin Joshua Z. , Park Hongkun , Regev Aviv. (англ.) // Nature. — 2013. — 19 May ( vol. 498 , no. 7453 ). — P. 236—240 . — ISSN . — doi : . [ ]

Ссылки

  • Логотип YouTube : плей-лист (17 видео) от Bioinformatics Training — University of Cambridge
  • Логотип YouTube А. Предеус, Институт биоинформатики
  • Логотип YouTube П. Мазин, Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ
  • (англ.) . rnaseq.uoregon.edu. Дата обращения: 29 апреля 2017.
  • Логотип YouTube Константин Зайцев, Washington University in St.Louis, Институт биоинформатики
  • Логотип YouTube Константин Оконечников, Институт биоинформатики
  • Логотип YouTube Константин Оконечников, Институт биоинформатики
Источник —

elizabeth
  • 2020-08-17
  • 1

Same as Транскриптомика одиночных клеток

The title for the last searches