Эпигено́мика ( англ. Epigenomics) — раздел молекулярной биологии , изучающий совокупность эпигенетических модификаций генетического материала клетки ( ^* ) с помощью высокопроизводительных методов. Эпигеномика аналогична геномике и протеомике , которые изучают геном и протеом клетки, соответственно .

Эпигенетические модификации — это обратимые ковалентные химические модификации клеточной ДНК и гистонов , которые влияют на экспрессию генов , не изменяя нуклеотидную последовательность ДНК . Механизмы внесения ковалентных модификаций ДНК и гистонов и их влияния на экспрессию генов являются предметом изучения эпигенетики, а эпигеномика изучает результат — эпигенетические модификации и их распределение по геному при помощи молекулярных методов, таких как ChIP-seq , бисульфитное секвенирование и другие.

Самые изученные эпигенетические модификации — это метилирование ДНК и модификации гистонов. Изучение эпигенома на глобальном уровне стало возможно лишь относительно недавно в связи с развитием высокопроизводительных методов изучения генома .

Эпигенетические модификации

Модификации генома, которые изменяют экспрессию генов , но не связаны с изменением первичной последовательности ДНК ( нуклеотидной последовательности) и передаются при митотическом и мейотическом делении клетки , называют эпигенетическими модификациями. Наиболее изучены такие эпигенетические модификации, как метилирование ДНК и модификации гистонов . Совокупность всех эпигенетических модификаций ДНК в клетке называют эпигеном. Клетка поддерживает свой эпигеном на протяжении всей жизни, поскольку стабильность эпигенома непосредственно связана со стабильностью генома, так как эпигеном вовлечён в важнейшие клеточные процессы, например, репарацию ДНК . Изменения эпигенома клетки могут привести к превращению её в злокачественную . Изменения эпигенома могут быть связаны с развитием и других заболеваний человека, помимо разных видов рака , таких как сахарный диабет 2-го типа , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона , синдром ломкой X-хромосомы и синдром Прадера — Вилли .

Метилирование ДНК

Первой открытой эпигенетической модификацией стало метилирование ДНК. Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к нуклеотидам в составе ДНК. Ферменты , катализирующие эту реакцию , известны как ДНК-метилтрансферазы . Хотя метилирование ДНК — это стабильная и наследуемая модификация, существуют ферменты, удаляющие метильные метки с ДНК ( ). У эукариот метильная группа чаще всего присоединяется к пятому атому углерода азотистого основания цитозина в составе ДНК с образованием , или 5mC (как правило, в составе , в которых остатки цитозина соседствуют с остатками гуанина ) .

Нуклеотидные позиции, подвергающиеся метилированию, значительно различаются у разных видов и даже среди клеток одного организма. Животные используют метилирование ДНК по-разному; так, уровень метилирования ДНК у позвоночных очень высок, а у беспозвоночных он имеет средние значения. У некоторых организмов, таких как нематода Caenorhabditis elegans , 5mC и ДНК-метилтрансферазы полностью отсутствуют. Вероятно, в этих случаях роль метилирования ДНК выполняют иные механизмы .

В пределах одного организма уровень метилирования ДНК может значительно различаться на разных стадиях развития и в зависимости от участка генома. Например, у мыши примордиальные клетки зародышевой линии претерпевают полногеномное деметилирование, но на стадии имплантации зародыша метильные метки возвращаются на позиции, в которых они присутствовали у соматических клеток . Когда метилирование ДНК затрагивает промоторную область, то транскрипция соответствующего гена подавляется. Напротив, активно экспрессируемые гены, как правило, имеют неметилированные промоторы .

Механизм репрессии экспрессии генов через метилирование ДНК включает несколько этапов. С метилированными и неметилированными остатками цитозина взаимодействуют разные . Через них к участкам с 5mC привлекаются гистондеацетилазы , которые запускают ремоделирование хроматина , в результате которого ДНК становится недоступной для взаимодействия с компонентами аппарата транскрипции, такими как РНК-полимераза , что приводит к эффективной репрессии экспрессии генов .

Модификации гистонов

У эукариот геномная ДНК сопряжена с белками, образуя хроматин . Самые многочисленные белки хроматина — гистоны, на которые намотана двойная спираль ДНК . Гистоны обогащены положительно заряженными аминокислотами , что облегчает их связывание с отрицательно заряженным остовом ДНК за счёт электростатических взаимодействий. Основные повторяющиеся структурные единицы хроматина — нуклеосомы — представляют собой октамер , включающий по две молекулы коровых гистонов , , и , на который намотана нить ДНК длиной 146 пар оснований (п. о.). Нуклеосомы и намотанная на них ДНК формируют хроматиновую фибриллу диаметром 10 нм , которая может подвергаться дальнейшей конденсации .

Степень компактизации хроматина зависит от стадии клеточного цикла и может быть различной в разных участках генома . Степень конденсации хроматина связана с его транскрипционной активностью. Неконденсированный хроматин более транскрипционно-активен, чем плотно упакованный хроматин, так как он более доступен для аппарата транскрипции. Поэтому экспрессию гену можно модулировать за счёт ремоделирования хроматина и регулирования плотности его упаковки .

Ремоделирование хроматина осуществляется при помощи внесения посттрансляционных модификаций на N-концевые хвосты коровых гистонов . Совокупность модификаций гистонов в данной клетке называется . Известно множество видов модификаций гистонов: , метилирование, фосфорилирование , убиквитинилирование , , АДФ-рибозилирование , дезаминирование и . Ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинилирование часто связаны с активацией экспрессии генов, а метилирование, убиквитинилирование, SUMOилирование, дезаминирование и изомеризация пролина могут приводить к репрессии гена. Стоит отметить, что некоторые модификации, такие как метилирование, фосфорилирование и убиквинитилирование могут влиять на транскрипционную активность генов в зависимости от специфических аминокислотных остатков модифицируемых геномов. Кроме того, свой вклад вносит и модифицируемый участок генома. Так, метилирование лизина 36 гистона H3 (H3K36me) в кодирующей области гена приводит к его активации, а в промоторе — напротив, к инактивации .

Модификации гистонов влияют на экспрессию генов при помощи двух основных механизмов: за счёт разрушения контактов между нуклеосомами и за счёт привлечения АТФаз , ремоделирующих хроматин. Первый механизм реализуется при ацетилировании остатков лизина на хвостах гистонов, которое катализируется гистонацетилтрансферазами . Гистонацетилтрансферазы входят в состав мультибелковых комплексов , которые привлекаются к хроматину при связывании с ДНК белков-активаторов. Ацетилирование нивелирует положительный заряд остатка лизина, который стабилизирует взаимодействие нуклеосом с отрицательно заряженным остовом ДНК. Ацетилированные остатки лизина в составе гистонов способствуют диссоциации нуклеосом и декомпактизации хроматина. В декомпактизованном хроматине ДНК более доступна для аппарата транскрипции, поэтому ген становится более активным. могут удалять ацетильные группы с хвостов гистонов .

Второй механизм включает привлечение комплексов ремоделирования хроматина через связывание белков-активаторов с соответствующими энхансерами . Комплексы ремоделирования хроматина меняют положение нуклеосом несколькими способами, что может как повышать, так и понижать доступность ДНК для аппарата транскрипции. Примером комплекса ремоделирования хроматина может служить комплекс дрожжей ; он регулирует экспрессию нескольких генов через перестройки хроматина .

Методы

Целью эпигеномики является поиск и описание эпигенетических меток на глобальном уровне, подобно тому, как геномика изучает всю совокупность генетического материала клетки, а протеомика — совокупность всех клеточных белков . Подобно геномике и протеомике, важнейшую методологическую часть эпигеномики составляют биоинформатические подходы .

Анализ модификаций гистонов

Процессы транскрипции, репликации и репарации ДНК требуют взаимодействия геномной ДНК с ядерными белками. Известно, что некоторые участки генома особенно чувствительны к действию ДНКазы I , которая неспецифично расщепляет ДНК, не защищённую белками. Такие гиперчувствительные сайты считались транскрипционно активными участками генома, что подтвердилось их ассоциацией с РНК-полимеразой, а также топоизомеразами I и . В гиперчувствительных сайтах плотность упаковки ДНК понижена. Чаще всего гиперчувствительные сайты соответствуют промоторам, в которых ДНК должна быть открытой, чтобы с ней могли связаться компоненты аппарата транскрипции .

Полногеномный поиск эпигенетических модификаций впервые был выполнен с помощью метода ( англ. Chromatin immunoprecipitation, ChIP) вместе с ДНК-микрочипами (эта технология известна как ) . В случае ChIP-on-chip с помощью иммунопреципитации хроматина выделяют не транскрипционные факторы и ДНК-связывающие белки-активаторы, а модифицированные гистоны. Сначала гистоны in vivo ковалентно сшивают с ДНК при помощи обработки клеток формальдегидом . Далее клетки подвергают лизису , что делает возможным экстракцию и фрагментацию хроматина. Фрагментацию хроматина проводят с помощью обработки ультразвуком или эндонуклеазой рестрикции . В ходе такой обработки участки хроматина, не связанные с белками, разрушаются, так что остаются только комплексы ДНК с белками. Далее с помощью антител , специфичных к гистонам с определёнными модификациями, осуществляют иммунопреципитацию комплексов ДНК с такими гистонами . После иммунопреципитации ДНК и гистоны разделяют, фрагменты ДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции и метят (например, или Cy5). На финальной стадии флуоресцентно -меченную ДНК гибридизуют с фрагментами геномной ДНК, иммобилизованными на ДНК-микрочипе. По интенсивности сигнала, соответствующего каждому фрагменту, делают вывод о том, с какими из них взаимодействуют гистоны с интересующей эпигенетической меткой .

С помощью ChIP-on-chip был изучен эпигеном пекарских дрожжей , на основании этого были сделаны выводы о функциях определённых модификаций гистонов. Было показано, с какими эпигенетическими метками связаны репрессия или активация транскрипции и в каких участках генома они происходят. Хотя с помощью ChIP-on-chip удалось изучить эпигеном дрожжей с почти полным покрытием, применение этого метода для организмов с более крупными геномами, таких как человек , ограничено .

Для полногеномного изучения эпигенетических меток на больших геномах вместе с иммунопреципитацией хроматина используют высокопрозводительные методы, такие как (от англ. Serial Analysis of Gene Expression), секвенирование спаренных концов (PET от англ. Paired-end tag) и высокопроизводительное секвенирование (этот метод известен как ChIP-seq ). ChIP-seq включает стандартный протокол иммунопреципитации хроматина, однако вместо амплификации выделенной ДНК и её гибридизации на микрочипе её секвенируют с помощью высокопроизводительных методов. ChIP-seq показал себя как эффективный метод для анализа модификаций гистонов на глобальном уровне, выявления сайтов связывания белков, взаимодействующих с ДНК, причём с большим разрешением, чем дают другие методы .

Анализ метилирования ДНК

Методы определения нуклеотидной последовательности ДНК не подходят для обнаружения в ней метилированных нуклеотидов. В частности, при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) или бактериального клонирования метильные метки не сохраняются при удвоении ДНК, и эпигенетическая информация теряется. Методы гибридизации ДНК, в которых для определения последовательности исследуемых фрагментов ДНК и их положения в геноме используются радиоактивные пробы, также не подходят, поскольку они не различают метилированную и неметилированную ДНК .

Первый разработанный метод детекции метилированных нуклеотидов основан на применении эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В этом методе геномную ДНК обрабатывают двумя рестриктазами, которые распознают одну и ту же последовательность, но одна из них чувствительна к метилированию, а вторая — нет. Идея метода заключается в том, что метилированный сайт может быть распознан и разрезан только рестриктазой, не чувствительной к метилированию. Сравнивая фрагменты, полученные при обработке ДНК рестриктазой, чувствительной к метилированию и не чувствительной к нему, можно выявить участки, подвергающиеся метилированию. Этот этап включает амплификацию фрагментов, полученных в результате обработки рестриктазами, с помощью ПЦР, разделение их с помощью гель-электрофореза и анализ с помощью саузерн-блота .

Описанный выше метод был использован для анализа метилирования ДНК в локусе гемоглобинов человека. Различные гены этого локуса (γ-, δ- и β-глобины) экспрессируются на разных стадиях развития организма . Исследование подтвердило, что те гены, которые не экспрессировались, были обогащены 5mC .

Метод, основанный на применении рестриктаз, не позволяет изучить метилирование на уровне целого генома, то есть метилом. Даже в пределах локуса он не даёт полного представления о количестве и расположении метильных меток, так как информацию о метилировании можно получить только с тех участков, которые содержат сайты узнавания используемых рестриктаз. В связи с этим метод даёт большое количество ложноотрицательных результатов .

Впервые метилирование на уровне всего генома было изучено с помощью метода, известного как (RLGS, дословно «сканирование генома на предмет сайтов рестрикции»). В этом методе также используются ферменты, расщепляющие ДНК и чувствительные к её метилированию, однако разделение фрагментов происходит в ходе двумерного гель-электрофореза , что позволяет изучить расположение метильных меток детальнее .

Однако получить полное представление о метилировании геномной ДНК с высоким разрешением стало возможным только с появлением ДНК-микрочипов и методов секвенирования нового поколения . Как и в RLGS, новые подходы включают расщепление ДНК эндонуклеазами. В случае гибридизации с дифференциальным метилированием ( англ. differential methylation hybridization, DMH) одна проба геномной ДНК обрабатывается рестриктазами, чувствительными к метилированию, а другая — не чувствительными к метилированию ферментами. Далее фрагменты обеих проб амплифицируют и метят различными флуоресцентными метками , после чего наносят фрагменты из обеих проб на один микрочип. Уровень метилирования ДНК в данном локусе определяют как разность относительной интенсивности свечения двух красителей. Использование высокопроизводительного секвенирования позволяет добиться большего разрешения, чем применение ДНК-микрочипов. Микрочип для данного метода должен быть отнормирован в соответствии с плотностью CpG-островков, чтобы давать достоверные результаты. В частности, с помощью секвенирования можно выявить аллель -специфичное метилирование, кроме того, этот подход позволяет работать с более крупными геномами и не требует создания отнормированных микрочипов .

Бисульфитное секвенирование включает химическое превращение неметилированных остатков цитозина, поэтому далее их удаётся выявить с помощью обычного секвенирования. При обработке бисульфитом натрия и щёлочью неметилированный цитозин превращается в урацил , а метилированный цитозин остаётся интактным. Дальнейшая амплификация и секвенирование ДНК, не обработанной бисульфитом натрия, и ДНК, подвергшейся обработке, позволяет идентифицировать сайты метилирования. Подобно классическим методам, основанным на применении чувствительных к метилированию рестриктаз, бисульфитное секвенирование сначала применяли для изучения метилирования в пределах отдельных локусов, однако появление методов позволило использовать его для анализа метилирования на уровне целого генома. Однако в отличие от методов, основанных на применении рестриктаз, бисульфитное секвенирование даёт возможность выявить сайт метилирования с точностью до одного нуклеотида. К числу ограничений бисульфитного метода можно отнести неполное превращение метилированного цитозина в урацил, которое приводит к появлению ложноположительных результатов. Кроме того, при бисульфитном секвенировании может происходить разрушение ДНК, и протокол метода включает стадию удаления бисульфита натрия .

Для полногеномного анализа метилирования в паре с бисульфитным секвенированием используют технологии секвенирования нового поколения. Сочетание этих методов позволяет установить сайты метилирования с наибольшим метилированием из возможных, однако на этапе сборки прочтений в геном возникает много сложностей, связанных с пониженной сложностью последовательности ДНК, обработанной бисульфитом. Для борьбы с этим эффектом можно увеличивать длину прочтений; на таком подходе основано полногеномное секвенирование методом дробовика ( англ. whole genome shotgun bisulphite sequencing, WGBS). Метод WGBS, использующий платформу Illumina Genome Analyzer, уже был применён для анализа метилома растения Arabidopsis thaliana . Существуют также варианты бисульфитного секвенирования с ограниченной представленностью , которые особенно актуальны в случае организмов с большими геномами .

Анализ доступности хроматина

Под доступностью хроматина понимают меру того, насколько соответствующий ему участок генома открыт для взаимодействия с транскрипционными факторами и другими компонентами аппарата транскрипции. Недоступные участки, плотно упакованные с помощью нуклеосом, не подвергаются активной транскрипции, в отличие от открытых участков . Изменение доступности хроматина — это важный эпигенетический регуляторный процесс, благодаря которому достигается контекстоспецифичный или клеткоспецифичный уровень экспрессии определённых генов . Для изучения доступности хроматина в клетке применяются различные методы, такие как , DNase-seq , ATAC-seq и FAIRE-seq . Ключевой особенностью этих подходов является их способность к отделению ДНК, связанной с гистонами, от свободной ДНК. Эти последовательности затем выравниваются на , что позволяет установить их расположение .

MNase-seq и DNase-seq основаны на одном и том же принципе, а именно, расщеплении нуклеазами свободной ДНК, не связанной с гистонами или другими белками. В то же время фрагменты ДНК, взаимодействующие с белками, остаются нетронутыми, так что их можно отделить от белков и анализировать далее. Поскольку эти методы предполагают разрушение активных участков генома, их позицию можно установить лишь косвенно с помощью секвенирования уцелевших фрагментов ДНК и их выравнивания на референсный геном. В методе MNase-seq используется микрококковая нуклеаза , которая вносит одноцепочечный разрыв в цепь, комплементарную последовательности-мишени . В методе DNase-seq используется ДНКаза I, которая неспецифично вносит в ДНК . DNase-seq получил такое широкое распространение, что свободные от нуклеосом участки стали называть DHSs (от англ. Nase I hypersensitive sites) , а консорциум ENCODE выбрал этот метод для полногеномного анализа доступности хроматина . Главная проблема DNase-seq заключается в том, что разрывы могут вноситься неслучайно, что снижает качество получаемых результатов .

Метод FAIRE-seq ( англ. Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) начинается с сшивания ДНК с нуклеосомами и последующего расщепления ДНК с помощью ультразвука. Свободные и связанные фрагменты выделяют с помощью стандартной фенол - хлороформной экстракции, при этом фракция белков образует вязкую интерфазу, а свободная ДНК оказывается в водной фазе, откуда её можно взять для дальнейшего анализа . Обработка ультразвуком вносит случайные разрывы, поэтому фактор неслучайности здесь полностью исключён, а фрагменты, получающиеся после воздействия ультразвука, имеют большую длину, чем при ферментативной обработке (200—700 п. о.) . Благодаря этому FAIRE-seq может быть использован для анализа больших участков генома, однако он не даёт разрешения в одну нуклеосому. В отличие от методов, использующих нуклеазы, FAIRE-seq позволяет идентифицировать активные участки генома напрямую и включает более простую стадию пробоподготовки .

Метод ATAC-seq основан на применении транспозазы Tn5. Транспозаза вставляет в геном для секвенирования, причём с большей частотой в те участки генома, которые свободны от белков. Вставленные транспозазой адаптеры далее используются в ПЦР и последующем секвенировании .

Прямое выявление эпигенетических меток

Чувствительность ДНК-полимеразы , использующейся при одномолекулярном секвенировании в реальном времени , делает возможным непосредственно выявлять эпигенетические метки, такие как метильные группы, по мере перемещения полимеразы по секвенируемой молекуле ДНК . В нескольких проектах была показана применимость этого подхода для получения полногеномной эпигенетической информации у бактерий .

Нанопоровое секвенирование основано на выявлении изменений силы электрического тока при встрече с модифицированными нуклеотидами (например, метилированными). ДНК-полимераза обеспечивает погрузку одноцепочечной ДНК в пору миниатюрной камеры, заполненной раствором электролита , в которой из-за приложенного напряжения возникает электрический ток. Прохождение определённых нуклеотидов через пору уменьшает её сечение, доступное для ионов электролита, что приводит к уменьшению силы тока . Фиксируя такие изменения силы тока, можно выявить CpG-островки в ДНК, пропускаемой через пору. С помощью нанопорового секвенирования можно даже различить гидроксиметилирование и метилирование. Секвенатор MinION, разработанный , позволяет отличить неметилированный цитозин от метилированного без предварительной химической обработки . Технология нанопорового секвенирования также реализована в приборах Nanopolish и SignaAlign: первый позволяет оценить частоту метилирования в , а второй — его вероятность .

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени включает использование ( англ. Zero-mode waveguide). С нижней частью световода связана единственная молекула ДНК-полимеразы, матрицей для которой служит также единственная молекула ДНК. Каждый из четырёх нуклеотидов ДНК метят одним из четырёх различных флуоресцентных красителей. Когда ДНК-полимераза присоединяет очередной нуклеотид, с него удаляется флуоресцентная метка, а её световой сигнал регистрируется детектором. Когда в ходе секвенирования ДНК-полимераза встречается с модифицированным нуклеотидом в матрице, её кинетика изменяется: она ускоряется или замедляется уникальным для данной модификации способом. В ходе секвенирования флуоресцентные вспышки оцениваются не только по их спектрам эмиссии , но также по длительности и интервалам между вспышками. Эти параметры, известные как ширина пульса и межпульсовый интервал, позволяют оценить кинетику ДНК-полимеразы в данный момент времени. Ширина пульса есть функция всех кинетических этапов от присоединения нуклеотида до высвобождения флуорофора, а межпульсовый интервал определяется кинетикой связывания нуклеотидов и перемещением ДНК-полимеразы. В 2010 году было показано, что одномолекулярное секвенирование в реальном времени позволяет выявить такие модифицированные нуклеотиды, как , 5-метилцитозин и 5-гидроксилцитозин. Эти модификации по-разному изменяют кинетику ДНК-полимеразы, что и позволяет отличать их друг от друга .

В 2017 году был предложен комбинированный метод, включающий бисульфитное превращение неметилированных остатков цитозина и одномолекулярное секвенирование в реальном времени. Этот подход известен как одномолекулярное бисульфитное секвенирование в реальном времени ( англ. single-molecule real-time bisulfite sequencing, SMRT-BS) и представляет собой метод для прицельного анализа метилирования CpG-островков .

Теоретические модели

Первые математические модели для различных состояний нуклеосом, влияющих на экспрессию генов, были предложены в 1980-х годах. В дальнейшем эти идеи были почти полностью забыты, пока не появились экспериментальные данные о ковалентных модификациях гистонов и гистоновом коде . В последующем высокопроизводительные методы показали широкое распространение эпигенетических модификаций, что способствовало разработке новых теоретических моделей, описывающих появление, поддержание и изменение этих меток . Большинство из предложенных моделей описывают эпигенетические модификации в терминах одномерной решётки .

Редактирование эпигенома

Существует множество исследовательских методов, направленных на редактирование эпигенома. Изменения в эпигеноме происходят и при классических генетических экспериментах, приводящих к нокауту или нокдауну гена-мишени, делеции доменов белка, появлению точечных мутаций , мутаций приобретения или утраты функции. На эпигеном влияет и введение в геном искусственных последовательностей с индуцибельной экспрессией , а также введение в клетку векторов . Эпигеном может изменяться под действием биологически активных малых молекул , ингибирующих ферменты, которые отвечают за включение или удаление эпигенетических меток. Примером могут служить азацитидин и , необратимо ингибирующие ДНК-метилтрансферазы 1 и 3, а также , ингибирующий гистондеацетилазы. Направленное редактирование эпигенома связано с применением методов направленного редактирования генома , в которых используются , нуклеазы , а также система CRISPR / Cas9 . Редактирующий эффект связан с воздействием на ферменты, которые прямо или опосредованно вовлечены в удаление или внесение эпигенетических меток .

История

Термин «эпигенетика» впервые употребил Конрад Хэл Уоддингтон в 1942 году для обозначения молекулярных механизмов, которые определяют фенотипическое проявление гена. В течение последующих 50 лет эти механизмы были тщательно изучены, а также показано их влияние в обеспечении пластичности отдельных клеток и организма в целом .

Термин «эпигеномика» был предложен в 1997 году , когда благодаря развитию высокопроизводительных методов стало возможным изучение эпигенетических модификаций на уровне всего генома. В 2000-х началась работа по составлению карты эпигенома человека ( англ. Human Epigenome Project) . В 2003 году начал работу проект ENCODE , который стал первым международным проектом, использовавшим эпигеномные данные для поиска в геноме человека. В 2010 году был основан Консорциум по эпигеному человека ( англ. International Human Epigenome Consortium, IHEC), целью которого является получение 1000 эпигеномов клеток различных типов .

Примечания

Литература

• Gibson Greg, Muse Spencer V. A primer of Genome Science. — 3rd edition. — Sunderland: Sinaeur Associates, 2009. — ISBN 978-0-87893-236-8 .
• Russell Peter J. iGenetics: A Molecular Approach. — 3rd edition. — San Francisco: Pearson Benjamin Cummings, 2010. — ISBN 978-0-321-56976-9 .