V(D)J-рекомбина́ция , или V(D)J-реаранжиро́вка ( англ. V(D)J-recombination, V(D)J rearrangement ), — механизм соматической рекомбинации ДНК , происходящий на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов и приводящий к формированию антиген -распознающих участков антител и Т-клеточного рецептора . Гены ( англ. Ig ) и Т-клеточных рецепторов ( англ. TCR ) состоят из повторяющихся сегментов, принадлежащих к трём классам: V (от англ. variable ), D (от англ. diversity ) и J (от англ. joining ). В процессе V(D)J-перестройки генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе. Объединённая последовательность сегментов V(D)J кодирует вариабельные домены каждой из цепей рецептора или антитела .

Гены иммуноглобулинов и T-клеточных рецепторов

Молекула антитела (иммуноглобулина) представляет собой тетрамер из двух идентичных тяжёлых (H-цепей) и двух идентичных лёгких цепей (L-цепей). Каждая цепь имеет N-концевой вариабельный участок (вариабельный, или V-домен) и константный участок (константный, или C-домен) на . Вариабельный домен принимает участие в распознавании антигена , а C-домен отвечает за эффекторные функции. Как следует из названия, аминокислотная последовательность V-домена вариабельна, а C-домен демонстрирует выраженную консервативность . Максимальная изменчивость проявляется именно в области, ответственной за связывание антигена . Антигенсвязывающий участок формируется V-доменами тяжёлых и лёгких цепей (V _H - и V _L -домены соответственно) . L-цепь содержит один C-домен (обозначается C _L ), а H-цепь — 3 или 4 домена, которые обозначаются C _H 1, C _H 2, C _H 3, C _H 4. C-домены не участвуют в распознавании антигенов и необходимы для взаимодействия с рецепторами иммунных клеток , активации системы комплемента и других эффекторных функций .

В отличие от большинства генов, гены иммуноглобулинов и T-клеточных рецепторов не присутствуют в целом виде в клетках зародышевой линии и соматических клетках . Образование единого гена, кодирующего V- и C-домены, происходит посредством одного (в случае лёгких цепей) или двух (в случае тяжёлых цепей) актов соматической рекомбинации. V-домены и C-домены кодируются отдельными сегментами V-гена и C-гена соответственно, причём они не могут экспрессироваться поодиночке: в данной системе два «гена» кодируют единый полипептид — лёгкую или тяжёлую цепь. Любой из множества сегментов V-гена может соединиться с любым из нескольких C-генных сегментов. Лёгкие цепи образуются в результате единственного акта рекомбинации. Имеется два типа лёгких цепей: κ и λ. Лёгкая цепь λ образуется при рекомбинации между V _λ -геном и сегментом J _λ C _λ . Буквой J сокращённо обозначают участок, с которым соединяется сегмент V _λ , то есть реакция соединения происходит не напрямую между V _λ - и C _λ -сегментами, а через сегмент J _λ . Этот сегмент кодирует несколько аминокислотных остатков (а. о.) вариабельного участка и в гене, образованном рекомбинацией, сегмент V _λ -J _λ представляет собой один экзон , кодирующий весь вариабельный участок. В случае лёгкой цепи типа κ сборка цепи также осуществляется из двух сегментов, однако после гена V _κ следует группа из пяти сегментов J _κ , которая отделена от экзона C _κ интроном длиной от 2 до 3 тысяч пар нуклеотидов . В ходе рекомбинации V _κ -сегмент может соединиться с любым из J _κ -сегментов, и интактный вариабельный экзон в конечном счёте состоит из сегментов V _κ и J _κ . J _κ -сегменты, расположенные левее от рекомбинирующего J _κ -сегмента, удаляются, а J _κ -сегменты справа от рекомбинирующего сегмента становятся частью интрона между вариабельным и константным экзонами .

Тяжёлые цепи образуются в результате не одного, а двух актов рекомбинации, и в их образовании задействованы такие элементы, как V _H -ген, D-сегмент и V _H C _H -генный сегмент. D-сегмент представляет собой участок из 2—13 а. о., разделяющий последовательности, которые кодирует V _H -сегмент и J _H -сегмент. Участок D-сегментов на хромосоме также находится между множествами V _H -сегментов и J _H -сегментов. Объединение V _H -D-J _H происходит в две стадии: сначала один из D-сегментов соединяется с J _H -сегментов, а потом V _H -сегмент рекомбинирует с объединённым сегментом DJ _H . Получившаяся последовательность из трёх элементов V _H -D-J _H экспрессируется совместно с геном C _H , который находится справа от V _H -D-J _H и включает четыре экзона. У человека локус D-сегментов содержит 30 тандемно расположенных D-сегментов, а за ним располагается из 6 сегментов J _H . Каким образом обеспечивается, чтобы в актах рекомбинации D-J _H и V _H -D-J _H участвовал один и тот же D-сегмент, пока неизвестно. По названию отдельных элементов процесс сборки единого локуса, кодирующего лёгкую или тяжёлую цепь, получил название V(D)J-рекомбинации .

T-клеточный рецептор ( англ. T cell receptor, TCR ) представляет собой гетеродимер из двух субъединиц : α и β (рецептор TCRαβ) либо γ и δ (рецептор TCRγδ), которые кодируют гены TCRA, TCRB, TCRG и TCRD соответственно. Хотя последовательности , кодирующие δ-цепь ТCR, расположены внутри гена α-цепи, они обычно рассматриваются как отдельный генетический кластер. Как и в случае иммуноглобулинов, T-клеточный рецептор включает константные домены и кодирующие их C-гены, V-домены, которые кодируют V-гены, и разделяющие кластеры C-генов и V-генов J-сегменты (в генах TCRB и TCRD также присутствуют D-сегменты). При формировании каждой из четырёх возможных цепей TCR также происходит V(D)J-рекомбинация . В случае генов TCRB и TRCD, содержащих сегменты D, рекомбинация происходит в два этапа (сначала между сегментами D и J, потом между DJ и сегментами V), а в случае TCRA и TRCG — в один этап .

Таким образом, всего семь генных локусов подвержены V(D)J-перестройке: тяжёлой цепи иммуноглобулина (IgH), лёгких цепей κ и λ, а также четыре гена Т-клеточного рецептора, кодирующих цепи α, β, γ, δ: TCRA, TCRB, TCRG и TCRD соответственно. D-сегменты имеются только в гене тяжёлой цепи иммуноглобулина, TCRB и TCRD .

V-гены всех полипептидных цепей, участвующих в распознавании антигена, подвергаются перестройке, но не единовременно, а последовательно. В B-клетках сначала перестраиваются гены тяжёлых цепей, а затем — лёгких цепей (сначала перестраиваются лёгкие цепи типа κ, затем — типа λ). В T-клетках при формировании генов TCRαβ сначала перестраиваются гены β-, а потом — α-цепей. В случае TCRγδ перестройка генов вариабельных доменов γ- и δ-цепей происходит почти одновременно .

Механизм

V(D)J-рекомбинация проходит до конца только в T- и B-клетках под влиянием сигналов дифференцировки из внешней среды. Начальные этапы перестройки в виде DJ-рекомбинации могут происходить и в клетках , не относящихся к T- и B-клеткам, например, естественных киллерах , которые по происхождению близки к T-клеткам . Молекулярный механизм V(D)J-рекомбинации всех семи локусов иммуноглобулинов или T-клеточных рецепторов идентичный . Последовательность реакций V(D)J-рекомбинации описана в предыдущем разделе, здесь же будут описаны молекулярные механизмы V(D)J-рекомбинации.

Рекомбинация происходит по сигнальным последовательностям ДНК, непосредственно прилегающим к генным сегментам. Эти консервативные последовательности называются ( англ. recombination signal sequence , RSS) и состоят из семи нуклеотидов — 5'-CACAGTG-3' ( гептамер ), за которым следует последовательность из 12 или 23 нуклеотидов — спейсер , и ещё одного консервативного блока из девяти нуклеотидов — 5'-ACAAAAACC-3' (нонамер). Последовательность спейсера может варьировать, но длина консервативна и соответствует одному (12 нуклеотидов) или двум (23 нуклеотида) виткам двойной спирали ДНК. Перестройка происходит только между двумя RSS, одна из которых имеет спейсер 12 пар оснований (п. о.), другая — 23 п. о., так называемое «правило рекомбинации 12/23». Эта закономерность строения RSS определяет правильную последовательность рекомбинации: например, локус IGH имеет RSS длиной 23 п. о. на 3'-конце каждого V-сегмента, RSS длиной 12 п. о. на 3’- и 5’-конце каждого D сегмента и RSS длиной 23 п. о. на 5'-конце каждого J-сегмента. Таким образом, V-J-реаранжировка этого локуса невозможна. Порядок расположения консенсусных последовательностей у V- или J-сегментов может быть любым, то есть разные спейсеры служат лишь для предотвращения рекомбинации V- или J-сегмента с таким же сегментов и несут никакой значимой информации .

Для внесения разрывов в ДНК при V(D)J-рекомбинации необходимы и достаточны белки и ( англ. recombination activation genes ). Мыши , лишённые генов RAG1 и RAG2 , имеют только незрелые T- и B-клетки, поскольку неспособны формировать функциональные антитела и T-клеточные рецепторы. RAG1 распознаёт сигнальные последовательности с соответствующими спейсерами длиной 12 или 23 п. о. и рекрутирует RAG2 в реакционный комплекс. Сигнальная последовательность из 9 п. о. является сайтом первичного распознавания, а последовательность из 7 п. о. указывает место внесения разреза. В результате димеризации RAG1 и RAG2 связанные с ними последовательности сближаются, чему также способствуют комплементарные взаимодействия между сигнальными последовательностями, которые возможны благодаря их . В сближении последовательностей, связанных RAG1 и RAG2, также принимает участие гетеродимер HMG1/2. Комплекс RAG1/2 вносит одноцепочечный разрыв в каждый из двух участков, которые будут соединены в результате рекомбинации. На концах каждого из двух одноцепочечных разрывов имеются 5'-концевая фосфатная группа и 3'-концевая гидроксильная группа (3'-OH). 3'-OH, которая прилегает к кодирующему сегменту, в соответствующей позиции на другой стороне дуплекса ДНК. В результате этой реакции на месте каждого одноцепочечного разрыва формируется шпилька , в которой 3'-конец одной из двух цепей спирали ДНК ковалентно связана с 5'-концом второй цепи дуплекса. Шпильки на концах кодирующих сегментов распознаются гетеродимером из белков Ku70 и Ku80 , а белок раскрывает шпильки. Далее концы кодирующих сегментов соединяются по тому же механизму, что и при негомологичном соединении концов при репарации ДНК . Если недалеко от концевой шпильки происходит разрыв цепи ДНК, то на конце кодирующего сегмента формируется длительный одноцепочечный участок. Далее достраивается комплементарная к нему цепь, и в область конца кодирующего сегмента вводится несколько дополнительных нуклеотидов, которые формируют последовательность, палиндромную по отношению к исходной (поэтому их называют P-нуклеотидами от англ. palindromic ). Дополнительные нуклеотиды между кодирующими сегментами могут появиться и в результате другого процесса. Фермент терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) вводит небольшое количество (до 20, обычно менее 10) дополнительных случайных нуклеотидов (N-нуклеотидов) между концами сегментов, после чего они сшиваются по пути негомологичного соединения концов . Вырезанный участок, содержащий сигнальные последовательности RSS, замыкается с образованием кольцевидной структуры, известной как рекомбинационное вырезанное кольцо (REC от англ. Recombination excision circle ) .

Воссоединение концов кодирующих сегментов происходит по механизму негомологичного соединения концов при участии ферментов ДНК-лигазы IV, ДНК-зависимой протеинкиназы , белков Ku70/Ku80, и . На этом сборка гена, кодирующего цепь иммуноглобулина или TCR, завершается. ДНК-зависимая протеинкиназа участвует в активации белка Artemis, разрешающего шпильки, за счёт фосфорилирования . Совокупность белков RAG1, RAG2, ДНК-зависимой протеинкиназы, ДНК-лигазы IV, TdT, HMG1/2 и Ku70/Ku80 называют V(D)J-рекомбинационным комплексом .

Последствия

Благодаря V(D)J-рекомбинации в организме позвоночного животного создаётся колоссальное разнообразие антител. Один только локус тяжёлых цепей может дать более 10 ⁸ различных комбинаций V _H -J _H -C _H . Локусы лёгких цепей могут дать около миллиона рекомбинированных цепей типа λ или типа κ . Весь спектр антител в крови в 2008 году Джордж Чёрч предложил называть термином V(D)J-ом .

В некоторых случаях V(D)J-рекомбинация может приводить к возникновению инверсий или делеций . Так, иногда в локусах лёгких цепей типа λ сегмент V _λ имеет ориентацию на хромосоме, обратную ориентации локуса J _λ -C _λ , и разрыв и воссоединение в этом случае приведёт к инверсии удаляемого участка с сигнальными последовательностями вместо его вырезания из состава хромосомы (делеции). Функциональные последствия инверсии для иммунной системы не отличаются от последствий делеции. Рекомбинация посредством инверсии встречается в локусах TCR, тяжёлых цепей, а также лёгких цепей типа κ .

Когда перестройка конкретного V-гена завершается успешно, то экспрессия генов RAG останавливается, и ген на гомологичной хромосоме остаётся неперестроенным и не функционирует. Примерно две трети неудачных случаев V(D)J-рекомбинации связаны со сдвигом рамки считывания . В случае, если перестройка оканчивается неудачей, V(D)J-рекомбинация начинается на гомологичной хромосоме и при её успешном завершении ген на гомологичной хромосоме остаётся единственным функционирующим, то есть происходит аллельное исключение . В 45 % случаев V(D)J-рекомбинация происходит неудачно на обеих хромосомах лимфоцита , и он погибает апоптозом . В случае αβ-TCR при неудачной перестройке гена α-цепи процесс редактирования перезапускается и ген RAG экспрессируется повторно. Рекомбинация продолжается с участием Vα-сегмента, который не был вырезан из хромосомы и не попал в эксцизионное кольцо. Процесс может повторяться до образования функционального гена, кодирующего лёгкую цепь. При беременности или при распознавании T-клеткой аутоантигена может происходить редактирование гена α-цепи. Если редактируется ген α-цепи, который находится в зародышевой конфигурации на второй хромосоме из пары гомологов, то может возникнуть ситуация, нарушающая правило аллельного исключения: в одной T-клетке будет присутствовать два TCR с одинаковыми β-цепями, но разными α-цепями .

Нарушения V(D)J-рекомбинации приводят к развитию иммунодефицитных состояний. При синдроме тяжёлого комбинированного иммунодефицита уровень V(D)J-рекомбинации в локусах, кодирующих иммуноглобулины и T-клеточные рецепторы, очень низок. Причиной синдрома тяжёлого комбинированного иммунодефицита являются мутации , которые делают нефункциональными белки V(D)J-рекомбинаци: RAG1, RAG2, Artemis или ДНК-зависимую протеинкиназу .

История изучения

На основании данных о наличии константных и вариабельных доменов в молекуле иммуноглобулина Дрейер и Беннет в 1965 году высказали предположение о том, что в построении единой тяжёлой или лёгкой цепи иммуноглобулина участвуют два гена — V и C . В 1976 году Судзуми Тонегава начал серию экспериментов и показал, что гены, кодирующие антитела, претерпевают перестройки, за счёт которых создаётся огромное разнообразие антител . В 1987 году Тонегава получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие механизмов разнообразия антител .

Примечания

Литература

• Галактионов В. Г. Иммунология. — М. : Издат. центр «Академия», 2004. — 528 с. — ISBN 5-7695-1260-1 .
• Кребс Дж., Голдштейн Э., Килпатрик С. Гены по Льюину. — М. : Лаборатория знаний, 2017. — 919 с. — ISBN 978-5-906828-24-8 .
• Ярилин А. А. Иммунология. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 752 с. — ISBN 978-5-9704-1319-7 .
• Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai. . — Philadelphia: Elsevier Saunders, 2015. — ISBN 978-0-323-22275-4 .