Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин « культура клеток » относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор , содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней . Росс Гранвилл Харрисон , работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете , опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус , работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов ( Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс , Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa .

Основные вехи в развитии метода культуры тканей

1885 — Ру (Roux) продемонстрировал возможность поддержания клетками куриного эмбриона жизнеспособности вне тела животного в солевом растворе .

1907 — Гаррисон (Harrison) культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Он пытался показать, что аксоны образуются в виде выростов отдельных нервных клеток .

1910 — Раус (Raus) с применением фильтрованного экстракта куриной опухоли индуцировал опухоль. Позднее было показано, что в основе такого эффекта лежал РНКовый вирус саркомы Рауса .

1913 — Каррель (Carrel) доказал, что в асептических условиях клетки могут расти в культуре в течение длительного времени, если их обеспечить необходимыми питательными веществами .

1948 — Эрл (Earle) и сотрудники установили, что одиночные клетки линии L в культуре формируют клоны клеток .

1952 — Джей (Gey) и сотрудники получили перевиваемую клеточную линию из карциномы шейки матки; эта клеточная линия широко известна как HeLa .

1954 — Леви-Монтальчини (Levy-Montalchini) и сотрудники показали, что в культуре ткани фактор, стимулирующий рост нервов, вызывает рост аксонов .

1955 — Игл (Eagle) - впервые систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях культуры ткани и обнаружил, что клетки животных способны существовать в определенной смеси низкомолекулярных веществ, дополненной некоторым количеством белков сыворотки .

1956 — Пак (Puck) и сотрудники отобрали мутантные клетки HeLa, потребности которых для роста в культуре существенно отличались от потребностей других клеток .

1958 — Темин и Рубин (Temin, Roubin) количественно описали инфицирование клеток цыпленка в культуре очищенным вирусом саркомы Рауса. В течение следующего десятилетия Стокер, Дульбекко, Грин (Stocker, Dulbecco, Green) и другие вирусологи установили основные характеристики вирусной трансформации различных типов .

1961 — Хайфлик и Мурхед (Hayflick, Moorhend) показали, что в культуре фибробласты человека погибают после определенного числа делений .

1964 — Литлфилд (Littlefield) впервые использовал для выращивания гибридов соматических клеток селективную среду HAT. Это нововведение в сочетании с методом гибридизации клеток позволило приступить к изучению генетики соматических клеток .

1964 — Като и Такеуши (Kato, Takeuchi) получили целое растение моркови из растущей в культуре тканей клетки корня .

1965 — Хэм (Ham) предложил бессывороточную среду определенного химического состава, которая способна поддерживать рост клонов некоторых клеток животных .

1965 — Харрис и Уоткинс (Harris, Watkins) индуцировали вирусом слияние клеток мыши и человека и получили первые гетерокарионы клеток млекопитающих .

1968 — Августи-Точчо и Сато (Augusti-Tocco, Sato) адаптировали к условиям культуры клеток опухолевые клетки мыши (нейробластомы) и выделили клоны, которые реагировали на раздражение электрическим током и разрастались в нервные волокна. Одновременно получено большое количество других дифференцированных клеточных линий, включая линии скелетных мышц и печени .

1975 — Келер и Мильштейн (Kehler, Milstein) получили первые клеточные линии гибридом, секретирующих моноклональные антитела .

1976 — Сато (Sato) и сотрудники опубликовали первую серию статей, в которых было показано, что для роста в бессывороточной среде разным клеточным линиям необходимы различные смеси гормонов и факторов роста .

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин , проназа , разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта ( ex vivo ), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений такие клетки стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют , способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .

Клетки можно выращивать в суспензии , либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови ) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно изменённых таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трёхмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Эта система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии). С целью обеспечения необходимых физических условий для культивирования адгезивных культур и заселения объёма внеклеточного матрикса тканеинженерных конструкций используются системы динамического культивирования на основе роторных и вихревых биореакторов, биореакторов с непосредственным на скаффолд: компрессионных биореакторов, биореакторов с механическим натяжением и гидростатическим давлением, специальных биореакторов для электростимуляции клеток и тканей, а также комбинированных биореакторов .

Перекрёстное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

• Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
• Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
• Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл , рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать ( ).
• По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики ( пенициллин , стрептомицин ) и противогрибковые препараты ( амфотерицин B ).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH .

Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассирование клеток

Пассирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма . Суспензивные культуры пассировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, её обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

Трансфекция и трансдукция

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путём трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов . Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК .

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов . Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла . Этот метод называется трансдукция .

Линии клеток человека

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия .

Гибридома

Гибридома — это линия клеток, полученная в результате слияния нормальных лимфоцитов с «бессмертными» раковыми клетками. Используется для получения моноклональных антител . Лейкоциты, выделенные из селезёнки или крови иммунизированных животных, производят антитела с необходимой специфичностью, но как у любой первичной культуры, их способность к пролиферации ограничена пределом Хейфлика . Для иммортализации их искусственно сливают с «бессмертной» линией клеток миеломы , в результате чего происходит рекомбинация признаков. После этого линию клонируют и отбирают клоны, способные одновременно к неограниченной пролиферации и производящие антитела против избранного антигена .

Использование клеточных культур

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии .

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины , противоопухолевые препараты . Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого штаммом вируса H5N1 , в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов .

Бактериальные, дрожжевые культуры

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара . Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих , растений , грибов или бактерий , в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов . Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Виды клеточных линий

Краткий перечень клеточных линий

Приведённый здесь список наиболее распространённых клеточных линий не является полным и исчерпывающим.

Линия клеток	Расшифровка сокращения	Организм	Ткань	Морфология	Примечания и ссылки
293-T		человек	почка (эмбриональная)		Производная от HEK-293
3T3 cells	«3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells»	мышь	эмбриональные фибробласты		Известна также как NIH 3T3
721		человек	меланома
9L		крыса	глиобластома
A2780		человек	яичник	рак яичника
A2780ADR		человек	яичник	производное A2780 с резистентностью к адриамицину
A2780cis		человек	яичник	производное A2780 с резистентностью к цисплатину
A172		человек	глиобластома	злокачественная глиома
A431		человек	кожный эпителий	плоскоклеточная карцинома
A-549		человек	карцинома лёгких	эпителий
B35		крыса	нейробластома		(недоступная ссылка)
BCP-1		человек	периферические лейкоциты	HIV+ лимфома
BEAS-2B	bronchial epithelium + adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12SV40)	человек	лёгкие	эпителий	(недоступная ссылка)
bEnd.3	brain endothelial	мышь	кора головного мозга	эндотелий
BHK-21	«Baby Hamster Kidney»	хомяк	почка	фибробласты	от 27 декабря 2009 на Wayback Machine
BR 293		человек	молочная железа	рак
BxPC3	Biopsy xenograph of pancreatic carcinoma line 3	человек	панкреатическая аденокарцинома	эпителий	(недоступная ссылка)
C3H-10T1/2		мышь	эмбриональные мезенхимальные клетки
C6/36		Aedes albopictus (комар)	ткани личинки
CHO	Chinese hamster ovary	серый хомячок (Cricetulus griseus)	яичник	эпителий	(недоступная ссылка)
COR-L23		человек	лёгкие
COR-L23/CPR		человек	лёгкие
COR-L23/5010		человек	лёгкие
COR-L23/R23		человек	лёгкие	эпителий
COS-7	Cercopithecus aethiops, origin-defective SV-40	обезьяна Cercopithecus aethiops	почка	фибробласты
CML T1	Chronic Myelod Leukaemia T-lymphocyte 1	человек	хроническая миелоидная лейкемия	T-клеточная лейкемия
CMT	canine mammary tumor	собака	молочная железа	эпителий
D17		собака	остеосаркома
DH82		собака	гистиоцитоз	моноциты/макрофаги
DU145		человек	карцинома	простата
DuCaP	Dura mater Cancer of the Prostate	человек	метастазирующий рак простаты	эпителий	11317521
EL4		мышь		T-клеточная лейкемия
EMT6/AR1		мышь	молочная железа	эпителий
EMT6/AR10.0		мышь	молочная железа	эпителий
FM3		человек	метастазы в лимфатический узел	меланома
H1299		человек	лёгкие	рак
H69		человек	лёгкие
HB54		гибридома	гибридома	секретирует MA2.1 mAb (против HLA-A2 и HLA-B17)
HB55		гибридома	гибридома	секретирует L243 mAb (против HLA-DR)
HCA2		человек	фибробласты
HEK-293	human embryonic kidney	человек	почка(эмбриональная)	эпителий
HeLa	Henrietta Lacks	человек	рак шейки матки	эпителий
Hepa1c1c7	clone 7 of clone 1 hepatoma line 1	мышь	гепатома	эпителий	(недоступная ссылка)
HL-60	human leukemia	человек	миелобласты	клетки крови
HMEC	human mammary epithelial cell	человек		эпителий
HT-29		человек	эпителий толстого кишечника	аденокарцинома
Jurkat		человек	T-клеточная лейкемия	белые клетки крови
JY		человек	лимфобласты	В-клетки, иммортализованные EBV
K562		человек	лимфобласты	хроническая миелоидная лейкемия
Ku812		человек	лимфобласты	эритролейкемия
KCL22		человек	лимфобласты	хроническая миелоидная лейкемия
KYO1	Kyoto 1	человек	лимфобласты	хроническая миелоидная лейкемия
LNCap	Lymph node Cancer of the Prostate	человек	аденокарцинома простаты	эпителий	(недоступная ссылка)
Ma-Mel 1, 2, 3….48		человек		линии клеток меланомы
MC-38		мышь		аденокарцинома
MCF-7	Michigan Cancer Foundation-7	человек	молочная железа	инвазивная карцинома протоков молочной железы	ER+, PR+
MCF-10A	Michigan Cancer Foundation	человек	молочная железа	эпителий
MDA-MB-231	M.D. Anderson — Metastatic Breast	человек	молочная железа	рак
MDA-MB-468	M.D. Anderson — Metastatic Breast	человек	молочная железа	рак
MDA-MB-435	M.D. Anderson — Metastatic Breast	человек	молочная железа	меланома или карцинома (единого мнения нет)
MDCK II	Madin Darby canine kidney	собака	почка	эпителий
MOR/0.2R		человек	лёгкие
NCI-H69/CPR		человек	лёгкие
NCI-H69/LX10		человек	лёгкие
NCI-H69/LX20		человек	лёгкие
NCI-H69/LX4		человек	лёгкие
NIH-3T3	National Institutes of Health, 3-day transfer, inoculum 3 x 10 5 cells	мышь	эмбрион	фибробласты
NALM-1			периферическая кровь	хроническая миелоидная лейкемия
NW-145				меланома	от 16 ноября 2011 на Wayback Machine
OPCN / OPCT	Onyvax Prostate Cancer….	человек		линии клеток рака простаты	от 7 июля 2011 на Wayback Machine
Peer		человек	T-клеточная лейкемия
PNT-1A / PNT 2				линии клеток рака простаты
RenCa	Renal Carcinoma	мышь		карцинома почки
RIN-5F		мышь	поджелудочная железа
RMA/RMAS		мышь		T-клеточный рак
Saos-2		человек		остеоксаркома
Sf-9	Spodoptera frugiperda	бабочка Spodoptera frugiperda	яичник
SkBr3		человек		карцинома молочной железы
T2		человек		гибридома В-клеток и Т-клеточной лейкемии
T-47D		человек	молочная железа	карцинома протоков
T84		человек	карцинома толстого кишечника/ метастазы в легкое	эпителий
THP1		человек	моноциты	острая миелоидная лейкемия
U373		человек	глиобластома-астроцитома	эпителий
U87		человек	глиобластома-астроцитома	эпителий
U937		человек	лейкемическая моноцитарная лимфома
VCaP	Vertebra Prostate Cancer	человек	метастазирующий рак простаты	эпителий	от 19 февраля 2012 на Wayback Machine
Vero	'Vera Reno' ('почка зелёной') / 'Vero' ('истина')	африканская зелёная мартышка	эпителий почки
WM39		человек	кожа	первичная меланома
WT-49		человек	лимфобласты
X63		мышь	меланома
YAC-1		мышь	лимфома
YAR		человек	B-лимфоциты	трансформированы EBV	от 20 сентября 2008 на Wayback Machine

См. также

• Биологическое бессмертие
• Культура тканей
• Выращивание органов
• Биотехнология
• Индуцированные стволовые клетки
• Ниша стволовой клетки
• Питательная среда для эмбрионов
• Культура клеток и тканей

Примечания

Ссылки